陳 柳，余 斌，倪 征，華炯鋼，葉偉成，云 濤，張 存

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江杭州310021)

鴨瘟病毒(DEV)基因組共含78 個ORFs，推測12 個編碼病毒囊膜糖蛋白，正式命名11 個，包括gK、gN、gC、gB、gH、gM、gL、gG、gD、gI、gE［1，2］。單純皰疹病毒(HSV)中囊膜糖蛋白大部分具有重要功能，參與了病毒吸附穿入過程、病毒誘導(dǎo)的細胞融合過程及病毒從核膜出芽、釋放過程等。因此包膜糖蛋白是病毒感染發(fā)病的關(guān)鍵所在，在誘導(dǎo)機體的免疫應(yīng)答作為保護性免疫誘導(dǎo)劑方面的作用十分重要，是研制病毒亞單位疫苗的主要免疫原［3］。

皰疹病毒gI 是一多功能蛋白，其核苷酸和氨基酸序列在不同亞科以及種屬間都存在較大差異。gI作為囊膜糖蛋白是病毒顆粒表面的抗原決定簇，具有一定的免疫性，Ghiasi 等表達了HSV－1 的7 種糖蛋白(gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI)，并比較了7 種蛋白在小鼠咽部感染中的免疫保護作用，發(fā)現(xiàn)接種重組gI 蛋白的小鼠在體內(nèi)產(chǎn)生高滴度中和抗體，具有明顯的免疫保護作用［4］。在α－皰疹病毒中，gI 常與gE 以功能性非共價復(fù)合物的形式存在并發(fā)揮功能，在單純皰疹病毒I 型(HSV－1)、水痘帶狀皰疹病毒(VZV)、偽狂犬病毒(PRV)感染的細胞和宿主中，gE/gI 復(fù)合物促進病毒粒子胞間轉(zhuǎn)染、介導(dǎo)病毒在細胞之間擴散。沒有g(shù)I/gE 復(fù)合體，病毒體外培養(yǎng)時只能產(chǎn)生很少的CPE，在體內(nèi)組織的擴散也很有限［4－6］。Schumacher D.等(2001)［7］研究表明，gI、gE 單基因缺失和gI/gE 雙基因缺失的MDV 病毒只能在單個細胞中檢測到，而不能形成病毒蝕斑，Devlin JM.等(2006)［8］在ILTV 上觀察到了同樣現(xiàn)象。此外，gI 蛋白還與病毒免疫逃避機制相關(guān)，HSV－1、VZV 和PRV gE/gI 異源二聚體與通過與IgG的Fc 片段相結(jié)合，改變或阻斷Fc 功能，參與免疫逃避［9］。HSV－1 中g(shù)I 的128－145 位氨基酸是結(jié)合IgG Fc 段的關(guān)鍵區(qū)，gI 缺失病毒也喪失了IgG 結(jié)合能力［10］。但牛皰疹病毒I 型(BHV－1)gE/gI 不能與Fc 結(jié)合［11］，其它皰疹病毒gE/gI 是否具有該特征尚待研究。

為了闡明DEV gI 的生物學(xué)功能，本研究在構(gòu)建鴨瘟病毒疫苗株全長感染性克隆的基礎(chǔ)上，采用“Red E/T”介導(dǎo)的兩步重組技術(shù)刪除gI 基因，構(gòu)建了DEV gI 基因缺失突變體克隆，并拯救獲得了重組病毒，對重組病毒生物學(xué)特性進行了初步研究。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒載體、菌株和病毒株 DEV 標準強毒株CHv(CVCC AV1221)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(北京);pEPkanS 質(zhì)粒和pCAGGS－NLS/Cre 質(zhì)粒由德國柏林自由大學(xué)Osterrieder N 博士惠贈;E.coli DH5α、DH10B 和GS1783 菌株由本實驗室保存。DEV 疫苗株全長感染性克隆pDEV－vac 及相應(yīng)病毒rDEV－BAC 由本實驗室構(gòu)建、保存。

1.2 工具酶和試劑 各種DNA 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶購自Takara(大連)公司;Primestar DNA聚合酶、Taq DNA 聚合酶購自Takara(大連)公司;DMEM 培養(yǎng)基購自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司;磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑購自Promega 公司;甲基纖維素購自Sigma 公司;胎牛血清購自Gibco 公司;胰酶購自Difico 公司。膠回收和病毒DNA/RNA 提取試劑盒購于Takara 公司。

1.3 引物設(shè)計 參考DEV 疫苗株序列(GenBank EU082088.2)，設(shè)計引物對DEV－ΔgI－for/ rev 和ΔgIJD－F/R 分別用于“Red E/T 介導(dǎo)的兩步重組”刪除gI 基因及鑒定基因刪除是否成功，序列如表1所示，由上海某生工合成。

1.4 試驗用SPF 雞胚 9－11日齡SPF 雞胚購自浙江某生物技術(shù)公司。

1.5 DEV gI 基因缺失突變體的構(gòu)建 采用兩步Red E/T 重組法構(gòu)建DEV 疫苗株gI 基因缺失株。首先將pDEV－vac 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli GS1783 株，提取質(zhì)粒以BamH I 酶切篩選，陽性克隆命名為pDEVvac/GS1783。將 pDEV－vac/GS1783 接 種 于 含 有CAM 的LB 培養(yǎng)基，32℃220 r/min 培養(yǎng)至A600 為0.5 ～0.7 時，42℃水浴搖床保溫30min 以誘導(dǎo)Red重組酶表達，常規(guī)方法制備感受態(tài)細胞。第一步Red 重組以Kan 抗性基因替代gI 基因序列。具體方法為:以引物DEV－ΔgI－for 和DEV－ΔgI－rev (序列見表1)擴增pEPKanS 質(zhì)粒模板上含有Ⅰ－SceⅠ酶切位點和卡那霉素抗性基因的DNA 片段(Ⅰ－SceⅠ－Kan)，產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收，以純水洗脫;取100 ng 電轉(zhuǎn)化pDEV－vac/GS1783 感受態(tài)細胞，32℃振蕩培養(yǎng)1 h 后涂布含34 μg/mL CAM 和50 μg/mL Kan 的LB 平板，32℃培養(yǎng)24 ～48 h。挑取陽性克隆提取質(zhì)粒，BamH I 和Xho I 酶切篩選正確重組的克隆(pDEV－ΔgI－Kan)進行第二次重組。第二步Red 重組將pDEV－ΔgI－Kan 質(zhì)粒中的Kan 抗性基因刪除。具體方法為:接種pDEV－ΔgI－Kan 菌落于液體培養(yǎng)基，于32℃220 r/min 培養(yǎng)過夜，次日轉(zhuǎn)接于2 mL CAM－LB 中，振蕩培養(yǎng)2 ～4 h，加入等量2% L－阿拉伯糖，繼續(xù)培養(yǎng)1 h 誘導(dǎo)表達Ⅰ－SceⅠ核酸內(nèi)切酶，然后再轉(zhuǎn)入42℃水浴搖床培養(yǎng)30 min進行Red 重組，最后32℃培養(yǎng)1 h。將細菌懸液作10－3～10－5稀釋后涂布于CAM 平板，32℃孵育24～48 h，挑取菌落同時點種于CAM 和Kan 平板。BamH I 和Xho I 酶切分析Cam 陽性和Kan 陰性的菌落，以篩選正確重組的克隆(pDEV－ΔgI)。以pDEV－ΔgI 為模板，用引物對ΔgI－JD－F 和ΔgI－JD－R(序列見表1)進行PCR 擴增，膠回收PCR 片段之后送至Invitrogen 公司測序。

表1 用于缺失DEV gI(US7) 的引物

1.6 重組病毒拯救 取4 μg pDEV－ΔgI 以磷酸鈣法轉(zhuǎn)染至CEFs，轉(zhuǎn)染細胞放于37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 ～6 d，直至熒光出現(xiàn)，收獲病毒，命名為rDEV－ΔgI。為 去除rDEV－BAC 病 毒基因 組 上的mini－F 序列，將4 μg pDEV－ΔgI 和1 μg Cre 重組酶表達質(zhì)粒pCAGGS－NLS/Cre 以磷酸鈣法轉(zhuǎn)染至CEFs 細胞，第2 d 鋪上含有1.5%甲基纖維素的DMEM 培養(yǎng)基，置37℃CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，直至出現(xiàn)病毒蝕斑，挑取非熒光蝕斑進行稀釋和傳代，經(jīng)過幾輪重復(fù)，直至獲得純化的非熒光蝕斑病毒。抽提病毒DNA，采用18F/15R 引物對，序列分別為5＇－AAAGCTTCGACGA GAGTATCAGCACTCATC－3＇和5＇－AGAATTCAAGCTT ATCGACGAACAACTAAGAGTTTGC－3＇進 行PCR 擴增鑒定mini－F 序列是否去除。鑒定正確的病毒命名為rDEV－ΔgI－Cre。

第三，定期對全區(qū)資產(chǎn)專管員進行紙質(zhì)業(yè)務(wù)和電腦業(yè)務(wù)培訓(xùn)，并制定出資產(chǎn)管理信息系統(tǒng)的業(yè)務(wù)流程，培訓(xùn)方式有集中培訓(xùn)、電話指導(dǎo)、網(wǎng)絡(luò)信息等。

1.7 重組病毒的生物學(xué)特性分析

1.7.1 重組病毒蝕斑大小測定 將rDEV－BAC 和rDEV－ΔgI 病毒凍存液用不同稀釋度進行稀釋，接種于12 孔板中的單層CEFs 上，2 h 后，換上含1.5%甲基纖維素的DMEM 培養(yǎng)基，置37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。在熒光顯微鏡下各拍攝100 個熒光蝕斑，采用Image J 軟件測量蝕斑面積并取平均值。用SPSS 11.5 軟件的One－way ANOVA 程序進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.7.2 重組病毒多步生長曲線測定 以常規(guī)病毒學(xué)方法測定rDEV－BAC、rDEV－ΔgI、rDEV－ΔgI－Cre 和DEV－vac 的體外增殖特性。CEFs 細胞單層接種0.02 MOI 病毒后，依次吸附90 min，PBS(pH 7.2)洗滌2 次，以冰浴的CBS 緩沖液(40 mmol/L 檸檬酸鈉、10 mmol/L 氯化鉀、135 mmol/L 氯化鈉，pH 3.0)處理3 min，PBS(pH 7.2)洗滌2 次，加入1 mL 維持液繼續(xù)培養(yǎng)。接種后0、12、24、36、48、60、72 h 分別收集細胞培養(yǎng)上清和細胞，細胞用PBS(pH 7.2)洗滌2 次。收集的上清和細胞凍存于－80℃直至進行滴度測定。分別取100 μL 細胞培養(yǎng)上清和細胞裂解液按照常規(guī)方法測定TCID50，每個稀釋度重復(fù)接種3 孔。計算上述各時間點收獲的病毒毒價，繪制病毒在體外的多步生長曲線。

1.7.3 重組病毒對鴨瘟強毒攻擊的免疫保護試驗

將15 羽20日齡無鴨瘟抗體的鴨子隨機分為3 組(n=5)，飼養(yǎng)于不同欄舍。兩組分別肌內(nèi)接種0.5 mL 含有1 ×105TCID50 病毒的rDEV－BAC 和rDEVΔgI 病毒液，第3 組作為對照組，接種同體積DMEM培養(yǎng)基。接種2 周后，皆肌內(nèi)注射100 × DLD50(50%致死劑量)的DEV 強毒株CHv，于2 周內(nèi)觀察供試鴨的患病及死亡情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 pDEV－ΔgI 突變體克隆的構(gòu)建 詳見圖1、圖2。

質(zhì)粒pDEV－ΔgI－Kan(第 一 步Red 重 組)和pDEV－ΔgI(第二步Red 重組)經(jīng)BamH I 和Xho I 酶切后電泳圖譜詳見圖1－b，電泳圖顯示了gI 基因酶切片段的遷移率變化，與預(yù)測圖譜(圖1－a)基本一致。以pDEV－ΔgI－Kan 和pDEV－ΔgI 克隆為模版，以引物ΔgI－JD－F 和ΔgI－JD－R 擴增gI 上下游部分序列(圖2)，并進行測序，結(jié)果顯示gI 基因成功缺失。綜合酶切圖譜和PCR 產(chǎn)物測序結(jié)果表明，pDEV－ΔgI突變體構(gòu)建成功。

圖1 pDEV－ΔgI 突變體克隆的BamH I和Xho I 酶切鑒定圖譜

圖2 pDEV－ΔgI 突變體克隆的PCR 鑒定圖

2.2 gI 基因缺失突變體病毒的拯救 詳見圖3。

圖3 rDEV－ΔgI 病毒感染CEFs 形成熒光蝕斑(a) 及rDEV－ΔgI－Cre 感染CEFs 形成病毒蝕斑(b) (24 h，100 ×)

以pDEV－ΔgI 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CEFs 細胞后24 h，在熒光顯微鏡下可以見到綠色的熒光蝕斑，表明成功拯救了rDEV－ΔgI 病毒(圖3－ a)。rDEV－ΔgI 可以在CEFs 細胞上繁殖和形成空斑，因此gI 基因不是DEV 在細胞上繁殖的必需基因。將pDEV－ΔgI 和pCAGGS－NLS/Cre 共轉(zhuǎn)染至CEFs 細胞，經(jīng)過幾輪非熒光蝕斑挑選和PCR 鑒定，獲得了去除載體序列的病毒rDEV－ΔgI－Cre(圖3－b)。

2.3 重組病毒生長曲線 詳見圖4。

圖4 rDEV－BAC、rDEV－ΔgI、rDEV－ΔgI－Cre和DEV－vac 在CEFs 上的體外生長曲線

測定重組病毒rDEV－BAC、rDEV－ΔgI 和rDEVΔgI－Cre 的生長曲線，并與親本毒株DEV－vac 進行了比較，圖4所示，不論是細胞內(nèi)還是細胞外病毒，其滴度從12 h 到60 h 穩(wěn)步增加，在此期間gI 基因缺失毒株病毒滴度較親本毒株稍有降低，但病毒滴度于72 h 接近并超過對照毒株。

2.4 重組病毒蝕斑大小測定 詳見圖5。

rDEV－BAC 和rDEV－ΔgI 感染細胞3 d 后，各拍攝病毒蝕斑照片100 例，并用Image J 軟件測定蝕斑面積并計算平均值。發(fā)現(xiàn)rDEV－ΔgI 蝕斑面積較rDEV－BAC 增加約60%。數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)。

圖5 rDEV－BAC 和rDEV－ΔgI 在CEFs 上的蝕斑面積測定及比較

2.5 重組病毒對鴨瘟強毒攻擊的免疫保護試驗詳見圖6。

圖6 重組病毒對鴨瘟強毒攻擊的免疫保護試驗

為研究重組病毒是否具有保護鴨體免于鴨瘟病毒強毒株攻擊能力，對2 組20日齡無DEV 抗體的鴨群分別通過肌內(nèi)注射1 ×105TCID50的rDEV－ΔgI、rDEV－BAC，1 組注射等體積培養(yǎng)基作為對照，2 周后采用DEV 強毒株攻毒，第3 d，對照組5 羽鴨子陸續(xù)出現(xiàn)鴨瘟癥狀或死亡，5 d 內(nèi)，對照組鴨全部死亡。rDEV－ΔgI 組第4 d 有1 羽鴨子死亡，至第5 d 有2羽鴨子死亡，之后再無鴨子死亡，而rDEV－BAC 注射組無鴨子死亡。圖6對各組鴨子的存活率進行了統(tǒng)計，rDEV－ΔgI 注射組存活率較對照組下降40%。

經(jīng)對照組和rDEV－ΔgI 試驗組死亡鴨進行病理學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)死亡鴨出現(xiàn)了典型的鴨瘟癥狀，包括血管損傷、組織出血，尤其是肝、腎、泄殖腔，消化道粘膜表面出現(xiàn)了典型的出血環(huán)和形成假膜或潰瘍。

3 小結(jié)與討論

皰疹病毒由于自身基因組較大的原因，感染性克隆的構(gòu)建一度受到了限制。但從20 世紀90年代新型DNA 載體系統(tǒng)——細菌人工染色體(BAC)技術(shù)的問世改變了該局面。研究者通過同源重組或者Cre－LoxP 特異位點重組等DNA 重組技術(shù)，將BAC載體插入到病毒基因組復(fù)制非必需位點成功構(gòu)建了許多皰疹病毒的感染性克隆。迄今為止，HSV－1、VZV、人細胞巨化病毒(HCMV)、EB 病毒、卡波氏肉瘤病毒(HHV－8，KSHV)、PRV、犬皰疹病毒(CHV)、BHV－1、MDV、EHV－1 等許多皰疹病毒都利用該技術(shù)克隆到E.coli 并穩(wěn)定保持為感染性克隆。

在病毒BAC 系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，利用隨機轉(zhuǎn)座子或定點RecA－或Rec E/T 介導(dǎo)的克隆，可在短時間內(nèi)快速構(gòu)建病毒突變體。Rec E/T 介導(dǎo)的克隆是基于λ 噬菌體Red 操縱子(Redα/Redβ/Redγ)和Rac 噬菌體RecE/RecT 同源重組酶進行的，即“Red E/T重組”。與RecA 介導(dǎo)的克隆需要較長的同源臂(約1 kb)不同，“Red E/T 重組”僅需35 ～50 bp 堿基序列作為同源臂，使PCR 產(chǎn)物或寡核苷酸可以直接作為供體分子對目標DNA 進行打靶修飾。因此，不僅簡化了同源重組的操作過程，而且提高了重組效率，同時，由于同源臂不受堿基序列組成的限制，可以人為隨意選擇，所以運用該技術(shù)可輕松地對各種DNA分子尤其是基因組或染色體大分子進行修飾。所以，該技術(shù)不僅操作簡單、快捷，而且可精準地在全長感染性克隆的基礎(chǔ)上進行序列修飾［13］。

本文在前期構(gòu)建的DEV 疫苗株感染性克隆的基礎(chǔ)上，利用兩步Red E/T 介導(dǎo)的克隆技術(shù)簡單、快捷地構(gòu)建了gI 基因缺失的BAC 突變體，所構(gòu)建的突變體與預(yù)期完全一致，未發(fā)現(xiàn)任何堿基意外的插入、缺失或突變。該BAC 突變體轉(zhuǎn)染CEFs 細胞后獲得重組病毒，顯示gI 是DEV 復(fù)制非必需基因。gI 缺失病毒較親本毒在細胞上的蝕斑面積增大，說明gI 蛋白在DEV 病毒細胞間擴散中所起的作用與同屬馬立克氏病病毒屬的MDV 具有顯著差異。gI基因缺失毒株對DEV 強毒攻擊的免疫保護能力下降，可能與病毒早期在鴨體內(nèi)增殖滴度稍有降低有關(guān)，具體原因有待進一步研究解析。

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