周 寅

(寧波市江北區(qū)畜牧獸醫(yī)站，浙江寧波315021)

免疫抗體檢測是防控高致病性禽流感的重要手段，蛋鴨在產(chǎn)蛋期間對采血反應(yīng)敏感，易造成養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)損失。因此，采用卵黃替代血清有著重要的臨床意義。

研究表明，卵黃通過制備進(jìn)行HI 試驗可以檢測禽流感疫苗免疫抗體水平，且制備方法有多種。本研究試用氯仿、PBST、PBS、生理鹽水等4 種不同試劑制備卵黃樣品，在相同條件下進(jìn)行禽流感HI 試驗，并與對應(yīng)血清進(jìn)行比對，從而確立一種適用于基層，準(zhǔn)確、簡單，便于大樣本操作的制備方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

禽流感H5 Re-6 亞型抗原和標(biāo)準(zhǔn)陽性血清:由哈爾濱某生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)，批號為20130218。

供試用卵黃及血清:從寧波市江北區(qū)某種鴨場選取個體差異不顯著的產(chǎn)蛋鴨20 羽，180日齡，經(jīng)H5N1 禽流感疫苗三次免疫，單羽籠養(yǎng)，收集鴨蛋40枚;同時采集對應(yīng)鴨的靜脈血，分離血清，對應(yīng)編號。

試劑:1%雞紅細(xì)胞懸液;氯仿(分析純)，購自寧波化學(xué)儀器廠;PBST(pH 7.2)、PBS(pH 7.2)、生理鹽水(0.9%)，實驗室配制。

其他用品:96 孔V 型微量板，無菌采血器、燒杯、微量振蕩器、5 mL U 形管，定量移液器。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同制備方法卵黃HI 抗體效價比較

氯仿萃取法:1 mL 卵黃加入1 mL 生理鹽水，充分混合后加入2 mL 氯仿，充分振蕩，靜置1 h，然后1500 r/min 離心10 min，取上清液備用。

PBST 直接稀釋法:1 mL 卵黃加入1 mL PBST，充分振蕩混勻后備用。

PBS、生理鹽水處理法:同PBST。

將同一編號經(jīng)四種不同方式處理的卵黃樣品和對應(yīng)血清，在相同條件下參照《GB/T 18936－2003高致病性禽流感診斷技術(shù)》規(guī)定的血清HI 方法進(jìn)行檢測，觀察樣品性狀和非特異性凝集情況，并對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.2 重復(fù)性試驗 抽取編號不同的三組樣品，在相同條件下重復(fù)3 次，觀察可重復(fù)性。

1.2.3 凍融前后不同方法制備的卵黃抗體效價比較 抽取編號不同的三組樣品，－20℃冷凍保存，2 d 后取出解凍，在相同條件下進(jìn)行HI 方法檢測，凍融兩次，比較凍融前后抗體效價的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法制備的卵黃樣品及對應(yīng)血清的HI 試

驗結(jié)果 詳見表1。

表1 不同方法制備的卵黃樣品及對應(yīng)血清的HI 試驗結(jié)果

由表1可見，經(jīng)氯仿、PBST、PBS、生理鹽水制備的樣品結(jié)果與血清HI 抗體效價都很接近，經(jīng)t 檢驗4 種方法制備的卵黃樣品抗體效價與血清抗體效價差異均不顯著(t ＜t0.05，P ＞0.05)。由此可見，4 種制備方法均能使卵黃很好地替代血清檢測禽流感疫苗的免疫抗體水平。

2.2 不同方法制備的卵黃樣品性狀及非特異性凝集情況 詳見表2。

表2 不同方法制備的卵黃樣品及血清HI 試驗

經(jīng)氯仿萃取法制備的卵黃樣品澄清透明，結(jié)果判定最為容易;PBST、PBS、生理鹽水直接稀釋法制備的樣品較為渾濁，但不影響結(jié)果判定。

由表2可見，氯仿萃取法制備樣品出現(xiàn)的非特異性凝集數(shù)量較少，與血清接近;PBS 與生理鹽水直接稀釋的樣品出現(xiàn)非特異性凝集較多。

2.3 重復(fù)性試驗 詳見表3。

表3 重復(fù)性試驗結(jié)果

由表3可見，采用不同方法制備的卵黃樣品平行試驗的抗體效價差異均在一個滴度以內(nèi)，重復(fù)性良好。

2.4 凍融前后不同方法制備的卵黃樣品及對應(yīng)血清抗體效價的變化比較 詳見表4。由表4可見，經(jīng)氯仿萃取法制備的卵黃樣品凍融前后抗體效價穩(wěn)定，與血清基本一致。PBST、PBS、生理鹽水經(jīng)直接稀釋法制備的卵黃樣品凍融一次后檢測結(jié)果比凍融前的抗體效價高出2 個滴度以上，經(jīng)t 檢驗差異極顯著(t ＞t0.01，P ＜0.01)，二次凍融后效價與一次凍融效價保持基本一致。

表4 凍融前后不同方法制備的卵黃樣品及對應(yīng)血清HI 試驗結(jié)果

3 小結(jié)與討論

3.1 通過4 種不同方法制備的卵黃樣品均能替代血清檢測禽流感疫苗的免疫抗體水平，其中氯仿萃取法是4 種方法中最為穩(wěn)定可靠，能溶解卵黃中的脂肪，將卵黃抗體提純，樣品澄清透明，與血清性狀相似，能很好替代血清檢測。但其方法繁瑣、費時，且有毒性。PBST、PBS、生理鹽水直接稀釋法只是將卵黃稀釋，雜質(zhì)較多，非特異性凝集偶有發(fā)生。凍融后效價波動較大，樣品只能常溫或4℃保存，保質(zhì)期較短。但優(yōu)點在于操作簡便，尤其是生理鹽水無論是自行配制或購買成品，都十分方便，適合大樣本、大批量的檢測工作。

3.2 在試驗操作中，直接稀釋法制備的樣品有時會出現(xiàn)非特異性凝集，可能與兩方面因素有關(guān):一是簡單稀釋后樣品溶液中脂類等雜質(zhì)較多;二是鴨蛋卵黃與體紅細(xì)胞存在非特異反應(yīng)。如何減少直接稀釋法的非特異性凝集需進(jìn)一步研究探討。在HI 試驗結(jié)果判定時要以沿斜面向下呈線狀流動作為完全不凝集的標(biāo)準(zhǔn)，若有時正面難以判斷，可從反面觀察判斷。

3.3 直接稀釋法制備的卵黃樣品在凍融后抗體效價會高于凍融前抗體效價，且用吐溫作為保護(hù)劑效果不很明顯。發(fā)生這種現(xiàn)象的原因尚不清楚，估計可能因卵黃免疫蛋白多以脂蛋白形式存在，凍融影響組織結(jié)構(gòu)，使蛋白與脂類分子間位置關(guān)系發(fā)生改變之故。

綜上所述，氯仿萃取法適用于小樣本檢測，精確度較高。如果用于基層獸醫(yī)實驗室日常免疫抗體檢測，樣本數(shù)量較大，且只需觀察效價整齊度和陽性率者，則以生理鹽水直接稀釋法較為適宜，但對出現(xiàn)非特異性凝集而影響群體免疫水平評估的樣品應(yīng)當(dāng)用氯仿萃取法重新制備檢測。