郭會玲，易 忠，艾尼瓦爾·臺外庫力，陶興洋，斯馬依·伊斯拉木，達力夏·孜乃提，包拉提，王 延，薛 英，魏玉榮*,黃 炯*

（1.新疆新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆喀什地區(qū)動物疾病控制與診斷中心，新疆 喀什 844000；3.新疆克拉瑪依綠成農業(yè)開發(fā)有限責任公司，新疆 克拉瑪依 834000；4.新疆塔什庫爾干縣畜牧獸醫(yī)站，新疆 塔什庫爾干 845250；5.新疆塔什庫爾干縣達布達爾鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，新疆 塔什庫爾干 845250；6.新疆昭蘇縣畜牧獸醫(yī)站，新疆 昭蘇 835600）

泰勒焦蟲表面抗原TaSP、spag-1和Tams1基因片段克隆與序列分析

郭會玲1，易 忠1，艾尼瓦爾·臺外庫力2，陶興洋3，斯馬依·伊斯拉木4，達力夏·孜乃提5，包拉提6，王 延1，薛 英1，魏玉榮1*,黃 炯1*

（1.新疆新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆喀什地區(qū)動物疾病控制與診斷中心，新疆 喀什 844000；3.新疆克拉瑪依綠成農業(yè)開發(fā)有限責任公司，新疆 克拉瑪依 834000；4.新疆塔什庫爾干縣畜牧獸醫(yī)站，新疆 塔什庫爾干 845250；5.新疆塔什庫爾干縣達布達爾鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，新疆 塔什庫爾干 845250；6.新疆昭蘇縣畜牧獸醫(yī)站，新疆 昭蘇 835600）

為了解泰勒焦蟲表面抗原基因特性，利用PCR方法對實驗室保存的泰勒焦蟲細胞表面抗原spag-1、Tams1和TaS部分基因片段進行克隆與序列分析。PCR結果顯示所擴增的spag-1、Tams1和TaSP部分基因長度分別為372bp，324bp和321bp。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，與本次測序表面抗原TaSP和Tams1基因片段同源性最高的蟲株登錄號分別為FJ895154和AF214797的泰勒焦蟲株，同源性分別高達100%與99.69%；與spag-1基因片段同源性最高的蟲株登錄號為X78188、XM949884和M63017，它們之間同源性為100%。

泰勒焦蟲；TaSP；spag-1；Tams1；克隆；序列分析

泰勒焦蟲病是蜱傳性血液原蟲病。泰勒焦蟲（Thei1eria annu1ata，T.annu1ata）表面抗原有子孢子表面抗原 （The sporozoite antigen，spag-1）、裂殖子/梨漿蟲表面抗原 （The merozoite/pirop1asm surface antigen, Tams1）和裂殖體表面抗原（Thei1eria annu1ata surface protein，TaSP）等。Spag-1是病原入侵和被宿主細胞識別所必須的，可溶性的spag-1作為ELISA抗原檢測T.annu1ata感染抗體非常有效[1]。Tams1是蟲體感染紅細胞時表面分泌的一種膜蛋白，具有較好的免疫原性，同樣存在抗原多樣性[2]。TaSP是一種免疫分子，感染宿主可以通過主要組織相容復合物(major histocompatibi1ity comp1ex，MHC)的遞呈產生抗TaSP的抗體[3]。TaSP、spag-1和Tams1在焦蟲--機體免疫中起到重要作用，其蛋白內部的高免疫原性區(qū)有可能成為研制亞單位疫苗的重要靶點。了解泰勒焦蟲表面抗原SPAG1、Tams1和TaSP基因特性可為其亞單位疫苗或診斷試劑的制備奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 樣品及主要試劑

DH5a宿主菌由本室保存，pMD18-T載體、Taq DNA聚合酶、限制性內切酶購自TaKaRa公司，P1asmid Minipreps Kit、Wizard Genomic DNA Purification Kit、Ge1 Extraction Kit均購自Promega公司。

1.2 焦蟲基因組提取

懸浮培養(yǎng)泰勒焦蟲細胞液3 mL，12 500 r/min離心30 s，加入300 μL PBS懸浮。使用Wizard Genomic DNA Purification Kit，參照試劑說明提取焦蟲基因組，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設計與PCR擴增

根據(jù)GenBank登錄的泰勒焦蟲spag-1、Tams1、TaSP及全基因組序列，應用軟件O1igo6.24進行引物設計，由北京捷瑞生物公司合成（表1）。以焦蟲基因組為模板進行PCR。

表1 擴增Tams1、SPAG1、TaSP基因的引物

Tams1、spag-1及TaSP基因部分片段的擴增：以提取的焦蟲基因組為模板，分別以Tams1 F/R、SPAG1 F/R及TaSP F/R為引物通過PCR擴增目的基因Tams1、spag-1及TaSP。反應體系如0.2 mL PCR管中加入：10×Pfu DNA po1ymerase緩沖液5 μL，10 mM dNTP 2 μL，MgC12（2.5 mM）2 μL，上下游引物(20 pmo1)各1 μL，Pfu DNA po1ymerase(5U)0.5 μL，加入ddH2O使反應總體積至50 μL。反應參數(shù)為：94℃5 min；94℃45 s，50℃35 min，72℃45 s，30個循環(huán)后，72℃保溫10 min。 PCR擴增結束后，取產物8 μL經瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定正確的目的條帶切膠回收，分別命名為基因Tams1、spag-1和TaSP。

1.4 PCR產物的克隆及序列測定

PCR產物回收與提取質粒酶切鑒定、篩選陽性克隆、pMD18-T載體連接，均按試劑盒說明操作。連接產物轉化感受態(tài)細胞DH5a。挑取經鑒定含相應基因片段的各克隆送上海生工生物技術有限公司進行測序。測序正確的克隆分別命名為pMD-TaSP、pMD-spag-1和pMD-Tams1。

TaSP、spag-1和Tams1基因的序列分析 運用DNAMAN及DNAStar軟件對測序結果進行分析，并與Genbank中相關序列進行同源性比對，運用MEGA5.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)生樹。

2 結 果

2.1 泰勒焦蟲表面抗原TaSP、spag-1及Tams1基因片段的PCR擴增結果

分別使用TaSP、spag-1和Tams1基因特異性引物進行PCR擴增，產物的電泳結果顯示TaSP、spag-1 和Tams1基因片段擴增大小分別是372bp，324bp，321bp，與預期條帶大小一致（見圖1）。

圖1 TaSP、spag-1及Tams1基因片段PCR產物

2.2 TaSP、spag-1及Tams1基因片段序列測定結果與系統(tǒng)發(fā)育樹的建立

經上海生工生物工程技術服務公司測序后，所得TaSP、spag-1和Tams1片段序列（）與Genbank中相關序列進行同源性比對，運用MEGA5.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖2、3、4）。

TaSP基因片段：gaagatcaacagcctttggaccctaatcaacttataga tcaagctgaacaatctcaagaacctatt caacctactgatgaatctccacagg aacaggaacagatagaaactcaagaatctgaagagttagagccagaaactgttacagtagaagttccagaacccgttacatcagaagaatctaaggaatctactcaa actgaacaaaaaccagaacaacctgaaccagttgatgaacctccagttcaacctactgaatctactcctactaaggcaagttctagtggtgatggagcagcccctt gtcatgggaaacaccatgatgatgactctgacgggaaagaatctaaatcc

spag-1基因片段：gaagttttgaaagttctggatgaactagtgaaggatgtaagcgaagaacatgttggaatagg agatt taagtgacccaagtagcagaac accaaatgcaaaaccagccgaact tggaccttcactagtgatacaaaatgta ccgtcagacccctcaaaagtgacaccaacacagccttcaaatttgccacaag taccaacaacagggccggggaacggg acggatggaacaacaacaggaccaggtggaaacggggaaggaggcaaagatttgaaggaaggagaaaagaaagaa ggattatttcaaaagatcaaaaacaaactc

TamsI基因片段：ttcaaaccttccaaagttctcttcgaaaagaaagaagtcggaaaaccaaacaatgccaagta tcttgatgttttcgtctttgtcagtgctgat tccaagaaggtcgtcagactcgactacttctataccggtgactcaaggttaaaggagacctacttcgagcttaaggacgataagtgggttcaaatgtcacaggcagatg caaacaaggccttgaacgccatggactcatcatggtcatccgattacaaaccagttgtcgacaagttctctccccttgcagtcttcgcctcagtactcatcgtcttctc atcagtcctt

將測序獲得的基因序列 （以Thei1eria annu1ata XJ標注）與Genbank數(shù)據(jù)庫中其他泰勒焦蟲進行比較。比對所用序列的登錄號見表2。

表2 本文所用到的Genbank數(shù)據(jù)庫中的泰勒焦蟲序列

從圖2可見本次測序獲得Tasp基因序列與Genbank登錄號為FJ895154的泰勒焦蟲株在同一進化分支，且序列同源性最高達100%，由此可以推測二者來源相同或屬于同一蟲株。從進化樹可見，本文比對的8條序列明顯聚類為兩大分支：中國新疆泰勒焦蟲蟲株與蘇丹蟲株（登錄號為EU032559、EU032559），它們的親緣關系更近，同源性達90%；中國寧夏、內蒙古及中國某地蟲株處在另一進化分支，同源性為95.5%，該進化分支與本次測序序列同源性約為85%。

圖2 基于Tasp基因的進化樹分析

從圖3可見，基于Tams1基因與Genbank其它泰勒焦蟲做遺傳進化分析也具有明顯的兩大進化分支。本次測序獲得Tams1基因與來自印度（登錄號AF21 4840）和蘇丹（登錄號AF214797）的蟲株親緣關系最近，同源性分別為99.38%和99.69%。中國甘肅株與突尼斯蟲株親緣關系較近，它們之間的同源性高達98.34%。測序的新疆株與甘肅株間的同源性為96.57%。

圖3 基于Tams1基因的進化樹分析

從圖4可以看出，基于spag-1基因所建立的進化樹聚類為兩大分支。本次測序獲得spag-1基因序列與土耳其（登錄號X78188、XM949884）及印度（登錄號M63017）蟲株親緣關系最近，它們之間同源性為100%，可見其來源相同或屬于同一蟲株。本次測序基因spag-1與蘇丹蟲株序列（登錄號AF128526）同源性為77.78%，親緣關系較遠。

圖4 基于spag-1基因的進化樹分析

3 討 論

近年來，T.annu1ata流行區(qū)域在逐漸擴大。簡子健等人利用間接ELISA血清學診斷方法，對2006-2008年期間新疆14地州市監(jiān)測點牛群進行T.annu1ata流行病學調查，發(fā)現(xiàn)新疆T.annu1ata感染的特點是疫區(qū)分布廣，感染率在11%以上，且有上升趨勢[4]。巴音查汗等人的調查表明新疆牛泰勒焦蟲病發(fā)病率和死亡率可達40%或更高[5]。鑒于T.annu1ata對養(yǎng)殖業(yè)的危害，筆者從分子生物學方面對T.annu1ata基因組片段進行了擴增并進行了遺傳進化分析。

本試驗對所保存的新疆泰勒焦蟲株表面抗原TaSP、spag-1和Tams1基因片段進行了克隆，并對序列進行分析。結果表明：擴增的新疆株泰勒焦蟲TaS基因序列與登錄號FJ895154中國新疆株親緣關系最近達100%，可能為同一起源或同一蟲株，同時該蟲株與蘇丹（登錄號為EU032559、EU032559）蟲株同源性也很高；Tams1基因序列與蘇丹（登錄號AF214797）及印度（登錄號AF214840）蟲株同源性高達99%以上；spag-1基因序列與土耳其 （登錄號X78188、XM949884）及印度 （登錄號M63017）蟲株同源性高達100%，但與蘇丹（登錄號AF128526）同源性較低。由于寄生蟲基因組龐大，Genbank中泰勒焦蟲全基因組序列信息非常有限，本次只是表面抗原基因片段測序，還不能推測所測序蟲株的準確起源。

綜上所述，本次對泰勒焦蟲表面抗原SPAG1、Tams1和TaSP基因片段進行克隆及測序，旨在了解測序蟲株的基因特性，為其亞單位疫苗或診斷試劑的制備奠定基礎。

[1]katzer F.,Carrington M.,Knight P.,et a1.Po1ymorphism of SPAG-1,a candidate antigen for inc1usion in a subunit vaccine against Thei1eria annu1ata[J].Mo1 Biochem parasito1,1994,（67）:1-10．

[2]Knighta,P.,Musokeb,A.J.,Gachanjab,J.N.,et a1.Conservation of neutra1izing determinants between thesporozoite surface Antigens of Thei1eria annu1ata and Thei1eria parva[J].Exp Parasito1,1996,82(3):229-241.

[3]Seitzer,U.,Bakheit,M..A.,Sa1ih,D.A.,et a1.From mo1ecu1e to diagnostic too1:Thei1eria annu1ata surface proteinTaSP[J].Parasito1 Res,2007,101(Supp1 2):S217-S223.

[4]簡子健,馬素貞,孫其喆,等.新疆牛環(huán)形泰勒蟲蟲病的流行病學調查[J].新疆農業(yè)科學,2011,48(8):1509-1513.

[5]曹雯麗,陳亮,劉啟生,巴音查汗.新疆牛環(huán)形泰勒蟲病的流行現(xiàn)狀和防治[J].草食家畜，2011,152(3):76-78.

Cloning and Sequence Analysis of TaSP,Spag-1 and Tams1 Gene Fragments of Theileria Annulata Surface Antigen

GUO Hui-1ing1,YI Zhong1,AINIWAERO·Taiwaiku1i2,TAO Xing-yang3，SIMAYIO·Yisi1amu4, DALIXIAO·Zimaiti5,BAO La-ti6,WANG Yan1,XUE Yin1,WEI Yu-rong1*,HUANG Jiong1*
（1.Institute of Veterinary Medicine,Xinjiang Academy ofAnima1 Sciences,Urumqi 830000,China；2.Contro1 and Diagnosis Center of the Anima1 Disease from Kashgar Region,Kashgar 844000,China；3.Ka1amayi Lucheng Agricu1tura1 Exp1oiture Co,.LTD,Ka1amayi 8340000，China；4.Tashkurgan Anima1 Husbandry and Veterinary Station in Xinjiang,Tashkurgan Xinjiang 845250，China; 5.Dabudar country Anima1 Husbandry and Veterinary Station in Tashkurgan, Tashkurgan Xinjiang 845250，China; 6.Zhaosu Anima1 Husbandry and Veterinary Station in Yi1i Region,Zhaosu Xinjiang 835600,China）

To study the genes characteristics of Thei1eria annu1ata surface antigen,gene fragments of spag-1 and Tams1 and Tasp were c1oned by PCR and sequenced.The resu1t showed that PCR products of genes fragment of TaSP,spag-1 and Tams1 were 372bp,324bp and 321bp,respective1y.After sequenced,phy1ogenetic tree was drew using genes fragment TaSP,Tams1 and spag-1.The ana1ysis of Phy1ogenetic tree revea1ed that he highest homo1ogy is 100%with the stain of accession number FJ895154 based on Tasp gene sequences of Thei1eria annu1ata,and it has a high homo1ogy with the stain of accession number AF214797 of 99.69%based on Tasp gene sequences of Thei1eria annu1ata.The sequence of spag-1 genes fragment is most simi1ar to the stain of accession number X78188,XM949884 and M63017 with 100%,respective1y.

thei1eria annu1ata；TaSP；spag-1；Tams1；c1one；sequence ana1ysis

S855.9

：A

：1003－6377（2014）02－0055-05

2014-01-11

國家自然科學基金項目（31160505）,十二五"國家科技支撐計劃（2013BAD2B04）

郭會玲（1973-），女，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動物傳染病研究。

魏玉榮（1978-），女，高級實驗師，主要從事動物傳染病研究。

黃炯（1963-），男，研究員，博士生導師，主要從事動物傳染病研究與生物制品研發(fā)。