基于DNA條形碼進(jìn)行金花茶組種間鑒別

陳 瑩， 郭蓓琳， 姚麗敏， 潘王韻， 曾菁菁， 呂祉龍， 杜彥蓉， 閆淑君

(福建農(nóng)林大學(xué)園林學(xué)院， 福州 350002)

DNA條形碼(DNA barcoding)是根據(jù)對(duì)一段標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列的分析來鑒定物種，已成為生物物種鑒定的新方向，受到世界40多個(gè)國(guó)家130多個(gè)組織中傳統(tǒng)生物分類學(xué)家、分子生物學(xué)家和生物信息學(xué)家等多學(xué)科專家的關(guān)注[1]。金花茶屬于山茶科、山茶屬，是山茶屬中罕有的花色金黃的品種[2-3]，被譽(yù)為“茶族皇后”及植物界的“大熊貓”。金花茶富含多種對(duì)人體健康有益的微量元素, 在醫(yī)療方面具有良好的功效，如利尿利濕, 清熱解毒等。常用于治療咽喉發(fā)炎、尿路感染、水腫、痢疾、高血壓、預(yù)防腫瘤等疾病[4-5]。近年來許多動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明, 金花茶具有提高機(jī)體免疫、抑制腫瘤增生、降血脂、降血糖等多種生理功能, 是優(yōu)良的功能性食品原料。植物類黃酮普遍存在于很多植物體內(nèi)。隨著研究的不斷深入, 葛根黃酮、銀杏黃酮等黃酮類成分在醫(yī)藥領(lǐng)域獲得了廣泛應(yīng)用，并且取得了長(zhǎng)足的發(fā)展。但不同金花茶黃酮含量不同[5]，其中檸檬金花茶黃酮含量最高。金花茶通過外觀很難辨別[4-7]。本研究應(yīng)用ITS、psbA-tmH、rpl 16、rpl 32、trnl-trnF序列對(duì)薄葉金花茶(Camelliachrysanthoides)、金花茶(Camellianitidissima)、顯脈金花茶(Camellieuphlebia)、檸檬金花茶(Camellialimonia)、小花金花茶(Camelliamicrantha)、凹脈金花茶(Camelliaimpressinervis)、小瓣金花茶(Camelliaparvipetala)、東興金花茶(Camelliatunghinensis)、毛瓣金花茶(Camelliapubipetala)進(jìn)行鑒定，為金花茶的準(zhǔn)確鑒定提供科學(xué)依據(jù)[10]。

1 材料與方法

1.1 樣 本

從GenBank下載不同來源的金花茶序列。

薄葉金花茶：1個(gè)psbA-tmH序列(登錄號(hào)：GQ 487336.1)、1個(gè)rpl 16序列(登錄號(hào)：GQ 487366.1)及2個(gè)trnl-trnF序列(登錄號(hào)：HQ 158589.1，GQ 487426.1)；

金花茶： 1個(gè)psbA-tmH序列(登錄號(hào)：GQ 487354.1)、1個(gè)rpl 16序列(登錄號(hào)：GQ 487384.1)及1個(gè)trnl-trnF序列(登錄號(hào)：GQ 487444.1)；

顯脈金花茶：1個(gè)psbA-tmH序列(登錄號(hào)：GQ 487339.1)、1個(gè)rpl 16序列(登錄號(hào)：GQ 487369.1)及1個(gè)trnl-trnF序列(登錄號(hào)：GQ 487429.1)；

凹脈金花茶：1個(gè)rpl 16序列(登錄號(hào)：GQ 487376.1)及2個(gè)trnl-trnF序列(登錄號(hào)：HQ 158590.1，GQ487436.1)；

檸檬金花茶：1個(gè)rpl 16序列(登錄號(hào)：GQ 487379.1)及1個(gè)trnl-trnF序列(登錄號(hào)：GQ 487439.1)；

小花金花茶：1個(gè)psbA-tmH序列(登錄號(hào)：GQ 487352.1)、1個(gè)rpl 16序列(登錄號(hào)：GQ 487382.1)及2個(gè)trnl-trnF序列(登錄號(hào)：HQ 158565.1，GQ 487442.1)；

小瓣金花茶：1個(gè)psbA-tmH序列(登錄號(hào)：GQ 487356.1)、1個(gè)rpl 16序列(登錄號(hào)：GQ 487386.1)及1個(gè)trnl-trnF序列(登錄號(hào)：GQ 487446.1)；

東興金花茶：1個(gè)rpl 16序列(登錄號(hào)：GQ 487371.1)及1個(gè)trnl-trnF序列(登錄號(hào)：GQ 487431.1)；

毛瓣金花茶：1個(gè)rpl 16序列(登錄號(hào)：GQ 487387.1)及1個(gè)trnl-trnF序列(登錄號(hào)：GQ 487447.1)。

1.2 序列處理

利用NCBI虛擬PCR的方法來獲取薄葉金花茶、金花茶、顯脈金花茶、簇蕊金花茶、弄崗金花茶、凹脈金花茶、檸檬金花茶、小花金花茶、小瓣金花茶、東興金花茶、淡黃金花茶、毛瓣金花茶ITS、psbA-tmH、rpl 16、rpl 32、trnl-trnF序列等共有的對(duì)應(yīng)區(qū)段，以備后續(xù)研究。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用MEGA 5.0軟件進(jìn)行種內(nèi)種間Kimura 2-parameter(K 2 P)遺傳距離分析，構(gòu)建鄰接(NJ)系統(tǒng)聚類樹及最近距離法(Nearsest distance)對(duì)薄葉金花茶、金花茶、顯脈金花茶、簇蕊金花茶、弄崗金花茶、凹脈金花茶、檸檬金花茶、小花金花茶、小瓣金花茶、東興金花茶、淡黃金花茶、毛瓣金花茶進(jìn)行鑒定分析。

2 結(jié) 果

2.1 trnl-trnF序列

2.1.1序列分析

利用NCBI虛擬PCR的技術(shù)方法來獲取所下載長(zhǎng)短不同的薄葉金花茶、金花茶、凹脈金花茶、檸檬金花茶、小花金花茶、小瓣金花茶、東興金花茶、顯脈金花茶、毛瓣金花茶trnl-trnF序列中共有的對(duì)應(yīng)片段，在系列1～822 bp之間獲得共有對(duì)應(yīng)系列，在345～349 bp間存在SNP位點(diǎn)。

2.1.2系統(tǒng)聚類樹鑒定結(jié)果

利用Meg 5.0軟件對(duì)所獲得樣本的trnl-trnF序列進(jìn)行構(gòu)建NJ系統(tǒng)聚類樹，詳見圖2。

由圖2可知：trnl-trnF序列條形碼可將顯脈金花茶系列單獨(dú)聚為一類，結(jié)果表明，trnl-trnF序列可應(yīng)用于顯脈金花茶與薄葉金花茶、金花茶、檸檬金花茶、小花金花茶、小瓣金花茶、凹脈金花茶、東興金花茶、毛瓣金花茶等8種金花茶之間的鑒別。

2.2 psbA-tmH序列

2.2.1序列分析

利用NCBI的技術(shù)方法來獲取所下載長(zhǎng)短一致的薄葉金花茶、金花茶、毛瓣金花茶、小花金花茶、小瓣金花茶、凹脈金花茶、顯脈金花茶、東興金花茶psbA-tmH序列中共有的對(duì)應(yīng)片段。在161～452 bp系列之間獲得共有對(duì)應(yīng)系列，在該片段中，僅有7個(gè)SNP位點(diǎn)，位點(diǎn)突變率僅達(dá)2.397%，可見在該系列中樣品進(jìn)化上的變異極小。并且在342 bp上毛瓣金花茶樣本存在與其他樣本特異性差別。

2.2.2系統(tǒng)聚類樹鑒定結(jié)果

應(yīng)用Meg 5.0軟件對(duì)所獲得樣本的psbA-tmH序列進(jìn)行構(gòu)建NJ系統(tǒng)聚類樹，詳見圖4。

由圖4可知，psbA-tmH序列條形碼可將毛瓣金花茶系列單獨(dú)聚為一類，結(jié)果表明，psbA-tmH序列可應(yīng)用于毛瓣金花茶與薄葉金花茶、金花茶、凹脈金花茶、小花金花茶、顯脈金花茶、小瓣金花茶、東興金花茶等7中金花茶之間的鑒別。

2.3 rpl 16序列

2.3.1系列分析

利用NVBI虛擬PCR方法獲取長(zhǎng)短不一致的薄葉金花茶、金花茶、顯脈金花茶、凹脈金花茶、檸檬金花茶、小花金花茶、小瓣金花茶、東興金花茶、毛瓣金花茶的rpl 16序列系列中共有的對(duì)應(yīng)片段，在105～786 bp系列之間獲得共有對(duì)應(yīng)系列，在該片段內(nèi)，位點(diǎn)突變率僅達(dá)1.320%，僅有9個(gè)SNP位點(diǎn)，可見在該系列中各樣本進(jìn)化上的變異極小。在102、104 bp上，薄葉金花茶樣本與其他樣本存在特異性差別。

2.3.2系統(tǒng)聚類樹鑒定結(jié)

應(yīng)用Meg 5.0軟件對(duì)所獲得樣本的rpl 16序列進(jìn)行構(gòu)建NJ系統(tǒng)聚類樹，詳見圖6。

由圖6可知：rpl 16序列條形碼可將毛瓣金花茶單獨(dú)聚類為一類，結(jié)果表明，rpl 16系列可應(yīng)用于毛瓣金花茶與薄葉金花茶、金花茶、顯脈金花茶、凹脈金花茶、檸檬金花茶、小花金花茶、小瓣金花茶、東興金花茶等8種金花茶的鑒別。

3 結(jié)果與討論

金花茶組植物(CamelliaSect.ChrysanthaChang)是一組唯一以黃色花朵著稱的山茶科山茶屬植物。金花茶組在園林與醫(yī)藥中均有較廣泛的應(yīng)用，自1979年建立金花茶組植物以來，新種和新變種以及變型的不斷公布，但由于形態(tài)極其相似，其品種之間的鑒別困難，金花茶組植物之間的關(guān)系難以通過經(jīng)典分類學(xué)進(jìn)行區(qū)分[2-3,7]。急需準(zhǔn)確快速的鑒定方法。近幾年來，DNA條形碼技術(shù)以其統(tǒng)一的操作標(biāo)準(zhǔn)和高穩(wěn)定性與可靠性的鑒定結(jié)果，在中藥基源的鑒定方面已經(jīng)被廣泛應(yīng)用[8-9]。本研究以trnl-trnF、rpl 16、psbA-tmH基因序列作為對(duì)金花茶組的DNA條形碼進(jìn)行了分析。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)的手段對(duì)不同金花茶的psbA-tmH、rpl 16、與trnl-trnF序列條形碼進(jìn)行遺傳距離與聚類分析，結(jié)果表明trnl-trnF序列最多只能在這些金花茶樣本中區(qū)分出顯脈金花茶。rpl 16系列可準(zhǔn)確地鑒別出毛瓣金花茶。psbA-tmH序列能準(zhǔn)確鑒別毛瓣金花茶。本研究所確定適用于對(duì)不同金花茶品種的條形碼序列，為進(jìn)一步利用不同條形碼進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定提供依據(jù)。