檢測(cè)雞痘病毒抗體間接ELISA方法的建立

黃卓文

(廣州市高級(jí)技工學(xué)校,廣東廣州 510420)

檢測(cè)雞痘病毒抗體間接ELISA方法的建立

黃卓文

(廣州市高級(jí)技工學(xué)校,廣東廣州 510420)

應(yīng)用雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)擴(kuò)增雞痘病毒(Fowlpox virus,FPV)并提純后作為抗原建立了具有較高特異性和靈敏性的間接ELISA方法。通過(guò)方陣滴定法來(lái)確定抗原最佳稀釋倍數(shù)為1：1600,待檢血清最佳稀釋倍數(shù)為1∶100。并檢測(cè)50份FPV免疫實(shí)驗(yàn)雞血清用本方法進(jìn)行檢測(cè),其陽(yáng)性檢出率為84%(42/50)。

間接ELISA；雞痘病毒；抗體

雞痘是由FPV引起的雞的一種接觸性傳染病。本病分布于世界各地，特別是大型雞場(chǎng)中更易流行，可使雞生長(zhǎng)遲緩、消瘦、產(chǎn)蛋量下降。若并發(fā)其它傳染病、寄生蟲病和衛(wèi)生條件、營(yíng)養(yǎng)狀況不良時(shí)，可引起大批死亡，尤其對(duì)雛雞造成更嚴(yán)重的損失，使用疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防是控制本病的重要措施[1]。

檢測(cè)雞血清中雞痘抗體，可以了解疫苗免疫狀況和機(jī)體感染情況。另外，F(xiàn)PV被越來(lái)越多用做載體構(gòu)建基因工程疫苗，用于動(dòng)物的免疫預(yù)防，所以，通過(guò)抗體的檢測(cè)還可以間接評(píng)價(jià)重組雞痘病毒對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的免疫狀態(tài)。雞痘病毒抗體的血清學(xué)檢測(cè)方法主要有免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、被動(dòng)血凝試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、熒光抗體技術(shù)和ELISA等[1～3]。對(duì)于比較常用的免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，由于沉淀抗體僅能在感染后的較短時(shí)間內(nèi)測(cè)出，所以采血時(shí)間不當(dāng)會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。然而ELISA具有特異、靈敏、穩(wěn)定、快速等優(yōu)點(diǎn)，被越來(lái)越多地用于雞痘病毒抗體的檢測(cè)[4]。

1 材料和方法

1.1 病毒和血清

FPV282E4株，雞痘陽(yáng)性血清為使用市場(chǎng)疫苗免疫SPF雞制備，陰性血清為1日齡SPF雞血清，待檢血清日常檢測(cè)樣品，新城疫、禽流感陽(yáng)性血清為使用市場(chǎng)新城疫疫苗、禽流感單價(jià)疫苗免疫SPF雞制備。

1.2 其他材料

鄰苯二胺（OPD）、羊抗雞IgG-HRP，犢牛血清，96孔酶標(biāo)板，SPF雞胚等。

1.3 抗原的擴(kuò)增及提純

取9～10日齡SPF雞胚按常規(guī)方法制作CEF，長(zhǎng)成單層后接種FPV，病變達(dá)80 %以上時(shí)收獲細(xì)胞；4℃2 000 r/min離心20min，沉淀重懸于PBS中；超聲波（60 W）裂解8個(gè)循環(huán)，每次15 s，冰浴45 s，36 %（W/V）蔗糖墊底，4℃15 000 r/min離心120 min，沉淀經(jīng)超聲波再次裂解4個(gè)循環(huán)；置20 %～50 %（W/V）蔗糖梯度上，4℃15 000 r/min離心90min，小心吸取病毒帶，0.1 %的甲醛滅活后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 間接ELISA試驗(yàn)最佳條件選擇

1.4.1 抗原包被和待檢血清最佳稀釋倍數(shù)的測(cè)定

以pH9.6的碳酸鹽緩沖液將抗原1∶100倍比稀釋至1∶12800，4℃24 h包被；然后用含0.05 %吐溫80的0.05mol/LPBS（簡(jiǎn)稱PBST，pH為7.2）洗5 min×3次，加入含10 %犢牛血清（FCS）的PBS，150μl/孔，37℃1 h封閉；PBST洗5 min×3次，將陽(yáng)性血清分別1∶50、1∶100、1∶200、1∶400稀釋，100μl/孔，37℃2 h進(jìn)行方陣試驗(yàn)；再用PBST洗5min×3次，每孔加1∶10 000稀釋的酶標(biāo)抗體100μl/孔，37℃2 h；PBST洗5 min×3次，加入OPD底物溶液100μl/孔，37℃10 min；用2 M的H2SO450μl/孔進(jìn)行終止后酶標(biāo)儀OD490讀數(shù)，每個(gè)稀釋度重復(fù)一次，取其平均值。

1.4.2 酶標(biāo)抗體工作濃度的選擇

待檢血清按1.4. 2確定的時(shí)間作用后，將酶標(biāo)抗體分1∶10 000、1∶15 000和1∶20 000稀釋，100μl/孔，其它步驟同1.4.2相同。

1.4.3 底物最佳顯色時(shí)間的選擇

酶標(biāo)抗體作用、洗滌、加入底物后，37℃分別作用5 min、10min、15min，用2M的H2SO450μl/孔終止后讀數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 抗原包被和待檢血清最適稀釋倍數(shù)的測(cè)定

方陣試驗(yàn)如表1所示，隨著抗原、血清稀釋倍數(shù)的增大，其OD值逐步減小。抗原稀釋倍數(shù)的逐漸變大，陽(yáng)性、陰性血清的OD值逐漸降低，但P/N值逐漸變大。隨著抗原稀釋倍數(shù)的繼續(xù)增大，由于陽(yáng)性O(shè)D值變化加快，而陰性O(shè)D值變化不太明顯，P/N值又逐漸變小。當(dāng)抗原以1∶1 600、待檢血清以1∶100稀釋時(shí)，OD值為0.997，約等于1，陰性O(shè)D值為0.067，遠(yuǎn)小于0.1，P/N值最大為13.9；同時(shí)，確定抗原1∶1600稀釋，待檢血清1：100稀釋。

2.2 酶標(biāo)抗體稀釋濃度的選擇

當(dāng)酶標(biāo)抗體1∶15 000稀釋時(shí)，陽(yáng)性O(shè)D值稍微降低，但P/N值最高，所以酶標(biāo)抗體最佳工作濃度為1∶15 000。

2.3 顯色時(shí)間的選擇

當(dāng)顯色時(shí)間10 min時(shí)，P/N最高，當(dāng)顯色時(shí)間為15 min時(shí)，OD值升高，但陰性值升高，P/N反而降低，所以顯色時(shí)間以10 min為佳。

2.4 特異性試驗(yàn)

間接ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示本抗原與其它幾種血清無(wú)交叉反應(yīng)。

2.5 臨床樣品檢測(cè)

對(duì)50份雞血清檢測(cè)結(jié)果如表1所示，隨著免疫后日齡增加，其陽(yáng)性率逐漸升高，陽(yáng)性率在免疫后18 d最高，達(dá)到100 %，樣品總陽(yáng)性率為82%。

表1 臨床血清樣品的間接ELISA檢測(cè)

3 討論

Buscaglia和Tripath等用中和試驗(yàn)和間接ELISA同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果中和試驗(yàn)陽(yáng)性檢出率很低，但用ELISA方法卻能明顯檢測(cè)出雞痘抗體的存在，證實(shí)了間接ELISA方法的靈敏性，此外，中和試驗(yàn)、熒光抗體免疫技術(shù)因穩(wěn)定性差、操作麻煩及儀器昂貴而難以廣泛應(yīng)用。而ELISA則以其特異、敏感、快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，被越來(lái)越多地用于雞痘抗體的檢測(cè)。在ELISA試驗(yàn)反應(yīng)中抗原抗體之間的免疫學(xué)反應(yīng)要經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后才會(huì)進(jìn)行充分，而酶的催化反應(yīng)與時(shí)間關(guān)系更大，這樣既能避免因反應(yīng)時(shí)間過(guò)短而引起的結(jié)果誤差，又不會(huì)因反應(yīng)過(guò)長(zhǎng)影響檢測(cè)的敏感性和特異性，針對(duì)情況本試驗(yàn)對(duì)每一步反應(yīng)時(shí)間都進(jìn)行了最佳選擇。其最佳反應(yīng)條件為：抗原最佳稀釋度為1：1600，37℃1 h進(jìn)行包被，用含有10 % FCS的PBS 37℃3h進(jìn)行封閉；待檢血清1∶100稀釋，37℃作用1.5 h；酶標(biāo)抗體1∶15 000稀釋，37℃作用1h；顯色為37℃10min。雖然間接ELISA具有以上優(yōu)點(diǎn)，但它對(duì)條件要求高，其中病毒的增殖和抗原的純化是其中最為關(guān)鍵的步驟。

[1] Sawata A，KKume Y.Nakase.Hemagglutinin ofHaemophilus para-gallinarum serotype 2 organisms：Occurrence and immunologicproperties of hemaglutinin[J].American Journal of Veterinary Re-search，2004，（43）：1311-1314.

[2] 徐春厚，孫力，于春生，等.用ELISA檢測(cè)雞痘病毒抗體的研究[J].中國(guó)畜禽傳染病，2006，（4）：33-35.

[3] 蔣成侏.酶免疫測(cè)定法[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1984：102-132.

黃卓文（1982-），男，工作單位：廣州市高級(jí)技工學(xué)校，獸醫(yī)助理講師，學(xué)士，研究方向：動(dòng)物醫(yī)學(xué)。