劉淵 尹時(shí)華 黃訓(xùn)健 周琦 舒競(jìng)鋮 韋順蓮
耳鳴、聽力下降和言語認(rèn)知能力減低是水楊酸鈉對(duì)聽覺系統(tǒng)毒副作用最明顯的三大癥狀[1],其中,耳鳴及聽力下降的原因還不明確。早期研究發(fā)現(xiàn),大劑量給予水楊酸鈉可引起豚鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡以及聽力損失,且凋亡率與聽力損失程度呈平行關(guān)系[2],但其凋亡機(jī)制還不甚明了。有研究表明,N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA受體)過度活化引起大量Ca2+內(nèi)流是水楊酸鈉致耳鳴的重要原因[3,4],細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載與細(xì)胞凋亡有著密切聯(lián)系[5],那么,NMDA受體過度激活是否也參與了水楊酸鈉致豚鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的過程呢?為此,本研究通過在豚鼠圓窗龕局部給予艾芬地爾(ifenprodil)(NMDA受體NR2B亞型的一種特異性受體阻滯劑[6])聯(lián)合腹腔注射水楊酸鈉,通過檢測(cè)給藥前后各組豚鼠ABR閾值、耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)caspase-3蛋白的表達(dá)及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡率,探討耳蝸局部特異性阻斷NR2B受體是否可以拮抗水楊酸鈉致豚鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷。報(bào)告如下。
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組處理 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為耳廓反應(yīng)靈敏、未暴露于噪聲及耳毒性藥物環(huán)境的健康花色豚鼠(廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供),實(shí)驗(yàn)前,應(yīng)用美國 TDT(Tucker Davis Technologies) 電生理測(cè)試系統(tǒng)進(jìn)行雙側(cè) ABR 測(cè)試,選取反應(yīng)閾小于40 dB SPL的豚鼠48只,隨機(jī)分為四組,每組12只。 Ⅰ組為空白對(duì)照組;Ⅱ組為人工外淋巴液(artificial perilymph,APL)組,左耳圓窗龕注人APL 60 μl;Ⅲ組為水楊酸鈉組,左耳圓窗龕注入APL 60 μl,腹腔注射水楊酸鈉;IV組為艾芬地爾組,左耳圓窗龕注入溶于APL的艾芬地爾(10 μmol/l)60 μl后,腹腔注射水楊酸鈉。于水楊酸鈉給藥前12 h圓窗龕給藥,水楊酸鈉注射量為400 mg·kg-1·d-1,連續(xù)注射 7 天。
1.2聽性腦干反應(yīng)檢測(cè) 于實(shí)驗(yàn)前及給藥結(jié)束后動(dòng)物處死前用美國TDT系統(tǒng)(Tucker Davis Technologies)對(duì)豚鼠雙耳分別進(jìn)行 ABR 測(cè)試。1%戊巴比妥鈉溶液對(duì)豚鼠行腹腔注射麻醉 (35 mg/kg),而后將其置于屏蔽倉內(nèi),記錄電極扎入額頂正中,參考電極接同側(cè)耳廓,鼻尖接地。插入式耳機(jī)給聲,短聲刺激,刺激率21.1次/秒,帶通濾波 300~3 000 Hz ,觀察時(shí)程20 ms ,疊加次數(shù)1 024次。最大輸出為110 dB SPL, 以10或5 dB遞減或遞增,以能引出明確的、可重復(fù)波III的最小刺激強(qiáng)度為ABR反應(yīng)閾。
1.3豚鼠圓窗龕局部給藥 用1%戊巴比妥鈉35 mg/kg對(duì)豚鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉后,固定于自制的動(dòng)物固定架上。常規(guī)消毒,左耳后下方做一弧形切口,鈍性分離組織,暴露聽泡,乳突尖骨質(zhì)鉆孔,看清圓窗龕,將浸泡于60 μl含有艾芬地爾(Sigma公司,10 μmol/L)的人工外淋巴液(APL,含NaCl 137、KCl 5、CaCl22、NaH2PO41 、Glucose 11、NaHCO312、MgCl21,pH 7.4±0.2)中的明膠海綿置于圓窗龕,用骨蠟封閉聽泡,逐層縫合。
1.4標(biāo)本取材及制備 最后一次ABR檢測(cè)(于最后一次水楊酸鈉給藥后的12 h時(shí)進(jìn)行)結(jié)束后立即行過量麻醉斷頭處死豚鼠,迅速取出顳骨,打開聽泡,暴露耳蝸,置于4%多聚甲醛0.01 M PBS(pH=7.4)固定液中,在解剖顯微鏡下挑破圓窗,取出鐙骨,于蝸尖處挑開一小孔,用微玻璃吸管由蝸頂灌注固定液1~2 min,可見固定液經(jīng)前庭階和鼓階由前庭窗和圓窗流出,再將標(biāo)本浸置于該固定液中,置4 ℃冰箱內(nèi)繼續(xù)固定6小時(shí)。0.1 M PBS浸洗過夜。10%脫鈣液脫鈣4周。梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟定向包埋后平行耳蝸縱軸連續(xù)切片,片厚5 μm,分別進(jìn)行TUNEL陽性細(xì)胞檢測(cè)(每組6只)及caspase-3免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)(每組6只)。
1.5Caspase-3免疫組織化學(xué)染色 切片置于60 ℃恒溫烤箱30 min;常規(guī)石蠟切片二甲苯脫蠟和梯度酒精水化;自來水沖洗,0.01M PBS(pH7.4)浸洗3次×3 min;切片置于0.01 M枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)放入高壓鍋高壓修復(fù)2 min,0.01 M PBS浸洗3次×3 min;3%H2O2室溫孵育10 min,0.01 M PBS浸洗3次×3 min;每個(gè)標(biāo)本滴加50 μl(1:50)抗caspase-3兔源單克隆抗體(Proteintech公司)4 ℃過夜,0.01 M PBS浸洗3次×5 min;滴加山羊抗兔IgG/辣根過氧化物酶標(biāo)記(中杉金橋公司),置于37 ℃恒溫烤箱中孵育30 min,0.01 M PBS浸洗3次×5 min;DAB(中杉金橋公司)顯色,自來水沖洗終止反應(yīng);蘇木素復(fù)染,自來水沖洗終止反應(yīng),自來水反藍(lán)10 min;梯度酒精脫水,二甲苯透明,烤干,中性樹脂封片。
1.6TUNEL染色方法 切片置于60 ℃恒溫烤箱30 min;常規(guī)石蠟切片二甲苯脫蠟和梯度酒精水化;自來水沖洗,PBS浸洗3次×3 min;新鮮3% H2O2甲醇溶液室溫處理10 min,滅活內(nèi)源性過氧化物酶,0.01 M PBS(pH7.4)浸洗3次×3 min;蛋白酶K消化,37 ℃孵育30 min,0.01 M PBS浸洗3次×3 min;吸水紙吸干周圍液體,加50 μl TUNEL反應(yīng)混合物(Roche公司),置于濕盒中37 ℃孵育60 min,0.01 M PBS浸洗3次×5 min;加轉(zhuǎn)換劑POD(Roche公司),置于濕盒中37 ℃孵育30 min,0.01 M PBS浸洗3次×5 min;DAB(中杉金橋公司)顯色,自來水沖洗終止反應(yīng);蘇木素復(fù)染,自來水沖洗終止反應(yīng),自來水反藍(lán);梯度酒精脫水,二甲苯透明,烤干,中性樹脂封片。
TUNEL陽性反應(yīng):光鏡下正常螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核呈藍(lán)色,凋亡螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核呈深淺不一的棕黃色,并且出現(xiàn)核固縮,染色質(zhì)濃集。螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptosis index,AI)=TUNEL陽性著色SGN細(xì)胞數(shù)/總SGN細(xì)胞數(shù)。
1.7圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 caspase-3染色切片在400倍視野下由Image-Pro Plus 6.0 專業(yè)圖像分析軟件測(cè)定累積光密度值(integrated optical density , IOD)和面積(area),并計(jì)算平均光密度值 (average optical density,AOD) ,平均光密度值越高,表達(dá)水平越高,凋亡效應(yīng)用凋亡率評(píng)價(jià)。組間進(jìn)行單因素方差檢驗(yàn),組內(nèi)進(jìn)行SNK檢驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料均采用SPSS 16.0專用統(tǒng)計(jì)軟件包分析。
2.1給藥后各組動(dòng)物ABR閾值比較 給藥后I、II組動(dòng)物ABR閾值分別為31.67±5.16和33.33±5.17 dB SPL,I、II組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),III組ABR閾值為64.17±7.36 dB SPL,較I、II組明顯升高(P<0.01),IV組為49.17±5.85 dB SPL,較I、II組顯著升高(P<0.01),但較III組顯著降低(P<0.01)。
2.2各組Caspase-3表達(dá)比較 I、II組動(dòng)物螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中無明顯著色,其平均光密度值分別為0.105 7±0.008 1和0.106 3±0.007 2,III組SGN細(xì)胞著色明顯,平均光密度值為0.3251±0.015 8,IV組SGN細(xì)胞著色明顯減弱,平均光密度值為0.197 3±0.014 5(圖1)。
2.3各組TUNEL染色結(jié)果 I、II組動(dòng)物螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞無明顯凋亡,凋亡率分別為4.35%±1.49%和5.25%±1.47%,III組SGN細(xì)胞凋亡明顯,凋亡率為76.62%±2.55%,IV組SGN細(xì)胞凋亡率為35.29%±3.51%,較III組明顯降低(圖2)。
圖1 各組動(dòng)物螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中Caspase-3的表達(dá) a~d分別為I~I(xiàn)V組(×400)
圖2 各組動(dòng)物螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡染色結(jié)果 a~d分別為I~I(xiàn)V組(×400)
螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是聯(lián)系耳蝸與聽覺中樞的樞紐,其中95%為Ι型螺旋神經(jīng)節(jié),它與內(nèi)毛細(xì)胞形成的突觸連接以谷氨酸為神經(jīng)遞質(zhì)將耳蝸編碼的聽覺信息傳入聽覺中樞。正常情況下,這種突觸間的遞質(zhì)傳遞是由α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor, AMPAR)介導(dǎo)的[7]。值得注意的是,螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞表面也有NMDA受體表達(dá),雖然該受體并不參與正常情況下神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞,但研究顯示這些受體在耳蝸興奮性毒性損傷的突觸修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用[8]。NMDA受體在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的生理作用,其可調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活,調(diào)節(jié)神經(jīng)元樹突、軸突結(jié)構(gòu)發(fā)育及參與突觸可塑性的形成等[9]。NMDA受體屬于配體門控離子通道,是由不同的亞單位組成的四聚體或五聚體,編碼這些亞單位的基因?qū)?個(gè)家族:NR1、NR2(包括NR2A~D)、NR3(包括NR3A、B)。NR1是NMDA受體復(fù)合物的功能性亞單位,單獨(dú)的NR2或NR3不能形成功能性受體,但它們可以和NR1聚合形成功能性復(fù)合物,由不同的亞單位組成的受體往往表現(xiàn)出不同的生理學(xué)和藥理學(xué)特性,最典型的就是由NR1和NR2B亞單位形成異聚體NR1/NR2B,其對(duì)Ca2+有高通透性[10],可被艾芬地爾選擇性阻斷。
研究發(fā)現(xiàn)NMDA受體的激活是細(xì)胞死亡的主要原因,這種細(xì)胞死亡繼發(fā)于急性興奮性的損傷[11]。生理狀態(tài)下各谷氨酸優(yōu)先興奮NMDA受體,在病理狀態(tài)下,某些不被激活的NR1/NR2B受體亞型被激活,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12]。NR2B受體的高表達(dá)可能改變NMDA受體的結(jié)構(gòu),功能及組成的改變,使離子通道的通透性異常增高,導(dǎo)致Ca2+超載,病理性Ca2+內(nèi)流會(huì)導(dǎo)致Ca2+依賴的一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)和磷脂酶A2的激活以及線粒體的功能失調(diào)[13~15],從而引起活性氧/氮及自由基的增加,最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷。另外,線粒體內(nèi)Ca2+上調(diào)可以提高ROS產(chǎn)物及細(xì)胞色素C的釋放,這些產(chǎn)物是凋亡小體的變構(gòu)及caspase-3活化所必需的,其結(jié)果是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16]。caspase-3是凋亡發(fā)生過程中時(shí)常被激活的一種蛋白酶,能催化細(xì)胞中許多關(guān)鍵蛋白質(zhì)的水解,caspase-3參與所有細(xì)胞凋亡過程中染色質(zhì)的凝集和DNA碎裂的過程。因此,它是細(xì)胞裂解及凋亡小體形成這一特殊過程的重要參與者[17]。
艾芬地爾是一種可與NMDA受體NR2B亞型高度選擇性結(jié)合的有機(jī)化合物,它通過阻斷NMDA受體的功能從而在動(dòng)物大腦缺血模型及損傷模型中發(fā)揮著神經(jīng)保護(hù)作用;同時(shí),它也在由谷氨酸及低氧損傷所致的細(xì)胞毒性過程中發(fā)揮著重要的保護(hù)作用[18]。有研究顯示,艾芬地爾可以阻斷由谷氨酸及NMDA引起的海馬細(xì)胞及視網(wǎng)膜細(xì)胞的興奮性損傷[19]。但艾芬地爾的這種保護(hù)作用的機(jī)制還存在爭(zhēng)議,以Tamura為代表的學(xué)者認(rèn)為亞精胺等內(nèi)源性多胺可與結(jié)合于NMDA受體復(fù)合結(jié)構(gòu)的多胺調(diào)節(jié)位點(diǎn)相互作用,從而促進(jìn)谷氨酸對(duì)NMDA受體的激活過程,而艾芬地爾正是通過阻斷多胺對(duì)這一激活過程的陽性調(diào)節(jié)作用從而非競(jìng)爭(zhēng)性的阻斷NMDA受體的功能[20~22]。而另一些學(xué)者[23]則認(rèn)為艾芬地爾并不是與多胺位點(diǎn)相互作用而是通過直接與NMDA受體作用發(fā)揮其細(xì)胞保護(hù)作用的。
本研究通過觀察腹腔注射水楊酸鈉后豚鼠耳蝸局部應(yīng)用NR2B受體阻滯劑艾芬地爾后,SGN中caspase-3的表達(dá)情況及TUNEL法檢測(cè)SGN凋亡率,發(fā)現(xiàn)艾芬地爾明顯阻斷了水楊酸鈉引起的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡,其機(jī)制可能與艾芬地爾選擇性的與NMDA受體的NR2B亞型結(jié)合,從而抑制由NMDA受體過度興奮促發(fā)的Ca2+內(nèi)流有關(guān)。有研究顯示[24],在離體培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元中加入艾芬地爾可以阻斷高電壓激活鈣通道,這種作用正是通過阻斷NMDA受體實(shí)現(xiàn)的。
目前,對(duì)艾芬地爾的細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制還知之甚少,目前國內(nèi)外的研究還僅僅停留在其與NMDA受體相互作用的水平,但這一保護(hù)過程的具體分子作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。
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