李煜 綜述 戴春富 審校

內(nèi)耳給藥是治療梅尼埃病、突發(fā)性聾等內(nèi)耳疾病的常用治療手段，該技術(shù)主要是利用某些藥物能滲透圓窗及卵圓窗的特點(diǎn)，或者直接運(yùn)用手術(shù)的方法，使藥物不經(jīng)過血-內(nèi)耳屏障直達(dá)內(nèi)耳組織細(xì)胞中，從而對疾病進(jìn)行治療[1]。內(nèi)耳局部用藥有著全身用藥無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，如藥物目的性強(qiáng)，可直接進(jìn)入內(nèi)耳，淋巴液中藥物濃度高，全身不良反應(yīng)少等[2]。目前如何有效、精確、定量給藥是內(nèi)耳局部給藥的難點(diǎn)。內(nèi)耳給藥技術(shù)與納米技術(shù)的結(jié)合，在內(nèi)耳疾病的治療領(lǐng)域有著廣闊的前景。聚乙二醇-b-聚(ε-己內(nèi)酯)(PEG-b-PCL)是一種近年來發(fā)展迅速的納米材料，具有穩(wěn)定性好、載藥能力強(qiáng)、有靶向性和可控性等優(yōu)點(diǎn)。為此，本文結(jié)合近年來國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，對PEG-b-PCL在內(nèi)耳給藥中的應(yīng)用研究進(jìn)行綜述。

1 內(nèi)耳給藥技術(shù)概況

1.1藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)及常用藥物 目前內(nèi)耳給藥研究當(dāng)中，藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)主要分為主動(dòng)和被動(dòng)兩大系統(tǒng)。藥物的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)通常使用外科手術(shù)(如耳蝸造口術(shù))的方法放置微流體泵并藉此將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至耳蝸，主要包括導(dǎo)管、微泵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)以及微流體交換系統(tǒng)[3]，此外，人工耳蝸的應(yīng)用也為藥物的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)提供了可能[4]。藥物的被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)主要包括鼓室內(nèi)注射、置管和滲透泵系統(tǒng)，其中，鼓室內(nèi)注射的方法具有臨床應(yīng)用方便、費(fèi)用較低、風(fēng)險(xiǎn)較小、有效性高的優(yōu)點(diǎn)[5]，是臨床工作當(dāng)中最常用的治療手段[6，7]。

在藥物的使用方面，糖皮質(zhì)激素應(yīng)用最為廣泛，主要應(yīng)用于梅尼埃病、自身免疫性疾病、突發(fā)性聾和耳鳴等疾病[8，9]。慶大霉素則在控制梅尼埃病眩暈發(fā)作方面受到了廣泛認(rèn)可[10，11]。此外，神經(jīng)遞質(zhì)及拮抗劑、單克隆抗體、細(xì)胞凋亡抑制劑等藥物也分別被應(yīng)用于耳鳴、自身免疫性內(nèi)耳病和耳聾等疾病[6]。

1.2問題與不足 內(nèi)耳給藥技術(shù)雖然發(fā)展較快，但現(xiàn)有的內(nèi)耳給藥方式依然存在著很多不足。藥物主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)雖然可控性強(qiáng)，但其成本較高，技術(shù)難度大；而目前臨床最常用的的鼓室內(nèi)直接注射地塞米松、慶大霉素等藥物的方法，也存在著諸多問題，如難以對進(jìn)入內(nèi)耳的藥物進(jìn)行精確的劑量控制，有可能造成聽力和平衡功能損害[12]，藥物的擴(kuò)散主要依賴被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的方式，可能會(huì)對治療效果產(chǎn)生影響[13]；直接給藥的方式缺乏靶向特定組織和細(xì)胞的能力。而PEG-b-PCL載體與鼓室內(nèi)注射、滲透泵等藥物被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的結(jié)合，有望改善和解決目前的狀況。

2 聚乙二醇-b-聚(ε-聚己內(nèi)酯)材料簡介

PEG-b-PCL是FDA認(rèn)證的藥物材料[14]，安全性高，屬聚合物囊泡類納米材料，是耳科研究中常用的藥物載體。該聚合物囊泡由兩親性嵌段共聚物分子經(jīng)有序組合形成的雙分子層泡狀結(jié)構(gòu)[15]，通常，該類材料的合成依賴在水溶液中進(jìn)行的自組裝，比較常見的有聚乙醇/聚氧化乙烯-b-聚酯類囊泡和聚乙醇/聚氧化乙烯-b-聚(L-氨基酸類)囊泡[16]。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上講，PEG-b-PCL由聚己內(nèi)酯構(gòu)成的疏水性膜，在疏水膜的內(nèi)外表面的腔隙內(nèi)嵌有親水的聚乙二醇，囊泡的中心是一個(gè)親水核。

相比脂質(zhì)體等納米載體，PEG-b-PCL體具有更加優(yōu)越的生物學(xué)特性：①嵌段共聚物分子可調(diào)節(jié)性強(qiáng)，使其具有更強(qiáng)的功能性和更豐富的多樣性[17]；②該材料具有親水核心和疏水性膜，因而其既可以將小分子量親脂性藥物包裝在膜中，又可以將親水性藥物以及DNA/siRNA封裝入水核之中[18]；③PEG-b-PCL具有相對較厚的膜結(jié)構(gòu)，因此，穩(wěn)定更性好，儲(chǔ)存容量更大，藥物存留時(shí)間也更長；④它能夠?qū)⑺幬镛D(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)耳并有效釋放，使藥物在特定結(jié)構(gòu)內(nèi)聚集。這些特點(diǎn)使之成為非常理想的生物材料和藥物載體。

2.1PEG-b-PCL用作藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的研究 將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)耳是PEG-b-PCL作為藥物載體應(yīng)用于內(nèi)耳給藥的基本要求。藥物經(jīng)中耳進(jìn)入內(nèi)耳的主要通路有兩條，一條路徑是經(jīng)圓窗膜進(jìn)入鼓階，另外一條是直接自鐙骨足板和環(huán)狀韌帶等結(jié)構(gòu)經(jīng)卵圓窗進(jìn)入前庭階[19，20]，目前，關(guān)于納米材料穿過圓窗膜入內(nèi)耳的機(jī)制研究甚少。圓窗膜超微結(jié)構(gòu)分為外上皮層、結(jié)締組織和內(nèi)上皮層[21]，圓窗膜外皮細(xì)胞擁有較為稀疏的微絨毛，提示其可能具有主動(dòng)吸收藥物的能力；而外皮細(xì)胞內(nèi)豐富的細(xì)胞器，如線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體可能在藥物的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)中起到作用[22]。Zou等[23]認(rèn)為圓窗膜內(nèi)上皮層的不連續(xù)性以及內(nèi)上皮細(xì)胞之間的較為疏松的細(xì)胞連接有可能在藥物擴(kuò)散中起到一定作用；而藥物進(jìn)入前庭階的機(jī)制，可能是通過鈣離子通道或鐙骨足板周圍的環(huán)狀韌帶[19,20]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，PEG-b-PCL能夠有效穿過圓窗及卵圓窗進(jìn)入內(nèi)耳結(jié)構(gòu)。Zhang等[24]利用熒光技術(shù)對PEG-b-PCL進(jìn)行標(biāo)記，對8～9月齡的雄性SD大鼠進(jìn)行圓窗龕處給藥，結(jié)果顯示血管紋毛細(xì)血管、基底膜、橢圓囊、球囊、螺旋神經(jīng)節(jié)等結(jié)構(gòu)均有PEG-b-PCL分布；Buckiová等[25]使用細(xì)胞膜紅色熒光探針對PEG-b-PCL進(jìn)行標(biāo)記，利用明膠海綿對成年C3H小鼠進(jìn)行圓窗膜給藥后，螺旋神經(jīng)節(jié)、柯蒂器、血管紋等結(jié)構(gòu)中均有熒光顯示，該實(shí)驗(yàn)亦對PEG-b-PCL的耳毒性進(jìn)行了測試，動(dòng)物ABR和DPOAEs檢測結(jié)果提示應(yīng)用該載體不會(huì)造成明顯的聽力損傷；但該實(shí)驗(yàn)并未對毛細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測以進(jìn)一步證實(shí)其安全性。

在對內(nèi)耳給藥方法的研究中，Zhang等[26]分別采取不同給藥方式選取大鼠進(jìn)行活體實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，耳蝸造口術(shù)是該載體進(jìn)入內(nèi)耳最行之有效的方式，而鼓室內(nèi)注射后載體在前庭的分布更為廣泛；作者認(rèn)為這種結(jié)果說明了卵圓窗有可能是PEG-b-PCL進(jìn)入內(nèi)耳的最重要途徑。

2.2靶向性研究 在靶向研究中，使用最多的方法是對PEG-b-PCL材料表面的聚乙二醇分子進(jìn)行共軛修飾，將配體與之結(jié)合，導(dǎo)向靶細(xì)胞，使藥物濃集于相應(yīng)的組織細(xì)胞中。

在Roy等[27]的研究中，人神經(jīng)生長因子hNgf_EE肽序列作為配體與PEG-b-PCL共軛結(jié)合，分別應(yīng)用于體外培養(yǎng)的小鼠耳蝸和PC-12大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞，結(jié)果顯示酪氨酸激酶受體和P75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體在hNgf_EE的介導(dǎo)下可與納米載體形成多價(jià)鍵結(jié)合，使其表現(xiàn)出對螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、雪旺施細(xì)胞和神經(jīng)纖維的高度親和力以及特殊靶向性；而對照組中未表現(xiàn)出特異的靶向性。另一方面，在該實(shí)驗(yàn)條件下PEG-b-PCL未見任何細(xì)胞毒性表現(xiàn)。

鑒于上述方案缺乏活體實(shí)驗(yàn)以證明其安全性，Tet1肽成為了一種新的選擇[28]；Tet1肽氨基酸序列為H-L-N-I-L-S-T-L-W-K-Y-R，它能夠與GT1b結(jié)合，對已分化PC-12細(xì)胞、初級運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞有較高親和力；GT1b受體相關(guān)基因在耳蝸中表達(dá)，而不參與螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，這樣的特性為Tet1的靶向性和安全性提供了理論依據(jù)。

近年來，Prestin蛋白也進(jìn)入了研究人員的視野，其對外毛細(xì)胞的電能動(dòng)性起到重要的作用[29，30]，并且僅在外毛細(xì)胞中表達(dá)，這使藥物在外毛細(xì)胞中特異性濃集成為可能。Surovtseva等[31]在實(shí)驗(yàn)中選取與Prestin蛋白有親和力的A665、A666肽段，將之與PEG-b-PCL共軛結(jié)合，該載體在體外培養(yǎng)的大鼠耳蝸外毛細(xì)胞中呈現(xiàn)出明顯的聚集現(xiàn)象。

對于藥物的定向運(yùn)送，Shapiro等[32]提出了新的思路，該實(shí)驗(yàn)建立了全新的雙磁體系統(tǒng)，改變了以往常見的單磁體吸引藥物的方式，可以將載有磁性藥物的納米載體沿磁場方向送出，并且使磁場強(qiáng)度維持在安全范圍之內(nèi)。雙磁體系統(tǒng)推動(dòng)藥物通過圓窗膜作為一種高效的手段，具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.3藥物控釋的研究 PEG-b-PCL作為可生物降解材料，其膜穩(wěn)定性尤為重要，提高膜穩(wěn)定性可以有效延長藥物存留時(shí)間，為藥物的控釋提供有利條件。在原有結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)之上，Katz等[33]對該材料進(jìn)行擴(kuò)展，在該研究中，PEG-b-PCL的己內(nèi)酯末端羥基與丙烯酸鹽形成酯鍵，并在紫外線的照射下高度聚合；新材料運(yùn)載能力強(qiáng)，膜穩(wěn)定性明顯增加，降解時(shí)間進(jìn)一步延長，代表了納米材料發(fā)展的一種趨勢。

關(guān)于載體的藥物釋放，磁場誘導(dǎo)藥物釋放在抗腫瘤的研究中被證實(shí)了具有可行性[34]，其具體方法是將藥物包裝入聚合物囊泡的同時(shí)，在聚合物囊泡的膜中封裝超順磁性氧化鐵納米粒子，在施加高頻諧波磁場后，藥物被載體釋放。這種現(xiàn)象產(chǎn)生的原因有可能是磁場于聚合物囊泡膜處產(chǎn)生局限性高溫，促進(jìn)藥物的釋放。在未來的研究中，或可將該技術(shù)引入到內(nèi)耳給藥的研究中，并與雙磁體靶向給藥系統(tǒng)相結(jié)合，以構(gòu)建內(nèi)耳給藥的新系統(tǒng)。

2.4安全性 PEG-b-PCL的安全性也是臨床應(yīng)用中的重點(diǎn)問題 Li等[35]對該載體進(jìn)行了細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果表明，該載體對Lo2細(xì)胞系及LoVo細(xì)胞系均無細(xì)胞毒性，提示PEG-b-PCL對正常腫瘤組織及正常組織均無細(xì)胞毒性。Buckiová等[25]對PEG-b-PCL的耳毒性進(jìn)行了測試，ABR和DPOAE結(jié)果顯示該載體對動(dòng)物聽力無明顯影響；但該實(shí)驗(yàn)并未對毛細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測。Roy等[27]對PEG-b-PCL在PC-12細(xì)胞中的細(xì)胞毒性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果表明該載體對PC-12細(xì)胞無細(xì)胞毒性。目前，針對該載體在內(nèi)耳給藥應(yīng)用中的安全性研究相對較少，仍需進(jìn)一步探究。

2.5其他 為了解分子量、分子成分對PEG-b-PCL粒子運(yùn)載能力及穩(wěn)定性的影響，Ukawala[36]合成含單甲氧基雙嵌段共聚物MPEG-PCL，在該實(shí)驗(yàn)中，研究人員通過改變?chǔ)?聚己內(nèi)酯與聚乙二醇的比值合成了不同分子量的MPEG-PCL分子，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，分子量大小和分子構(gòu)成比例明顯影響載體的藥物裝載效率、穩(wěn)定性和藥物釋放能力；同時(shí)，被轉(zhuǎn)運(yùn)的藥物本身也對納米粒子的穩(wěn)定性有著一定程度的影響。

如前所述，PEG-b-PCL的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)賦予了其優(yōu)越的特性，但是由于它的穩(wěn)定性高，合成所需的能量也相應(yīng)提高[37]，因而增加了生產(chǎn)成本。因此，在制作納米載體的過程中減少能耗，進(jìn)而降低成本也是人們關(guān)注的方面。Wang等[38]對另一種聚合物囊泡PMPC-PDPA 的研究值得借鑒，在該實(shí)驗(yàn)中，研究人員成功使用電穿孔法將6種不同藥物封裝入納米載體，而電穿孔后的納米載體本身并未發(fā)生顯著的形態(tài)學(xué)改變，為降低PEG-b-PCL載體藥物生產(chǎn)成本，提升生產(chǎn)效率提供了新的思路。

3 總結(jié)與展望

PEG-b-PCL是一種安全可靠、穩(wěn)定性強(qiáng)、具有高運(yùn)載能力的納米載體材料，人們在內(nèi)耳給藥的研究中不斷對其進(jìn)行探索與發(fā)展并取得了長足的進(jìn)步。然而，目前對PEG-b-PCL的研究還仍然存在著很多不足，其進(jìn)入內(nèi)耳的方式尚不明了，分布情況并不確切，缺乏定量的研究；靶向性以及藥物控釋等研究也不夠成熟，仍有大量的工作需要完成；此外，生產(chǎn)成本相對較高的問題也亟待解決。鑒于其優(yōu)越的生物學(xué)特性和廣泛地應(yīng)用，相信這些問題將會(huì)在未來的研究中得到解決，PEG-b-PCL在未來具有很大的臨床應(yīng)用潛力。

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