劉亮洪，張洪云，劉曉智，張立東，姜忠敏

(1天津港口醫(yī)院，天津塘沽300456;2天津市第五中心醫(yī)院)

膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展本質(zhì)上是多種基因共同作用致使基因表達(dá)失衡的結(jié)果，而基因表達(dá)受基因水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平及蛋白水平等多層面的調(diào)控，其中微小RNA(miRNA)在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控近年來(lái)倍受關(guān)注。miRNA是一類大小約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，通過(guò)與信使RNA(mRNA)的3'端非翻譯區(qū)(3'UTR)完全或不完全互補(bǔ)結(jié)合降解靶mRNA或抑制其翻譯，對(duì)其表達(dá)水平進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，在腫瘤的形成過(guò)程中發(fā)揮著類似癌基因或抑癌基因的作用［1，2］。我們?cè)谇捌诠ぷ髦邪l(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染miR-7后抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，但具體機(jī)制尚不清楚。2009年1月～2013年12月，我們觀察了腦膠質(zhì)瘤組織、U251細(xì)胞中miR-7、EGFR/PI3K信號(hào)通路相關(guān)(EGFR、PI3K和AKT2)基因蛋白的表達(dá)，并探討其關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇天津市第五中心醫(yī)院和港口醫(yī)院神經(jīng)外科收治的腦膠質(zhì)瘤患者42例，手術(shù)切除腫瘤組織，其中8例選取瘤旁正常腦組織。42例膠質(zhì)瘤患者按照WHO 2007年腦腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)分類:Ⅰ級(jí)6例，Ⅱ級(jí)16例，Ⅲ級(jí)9例，Ⅳ級(jí)11例。腦膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織均分為兩部分，一部分經(jīng)甲醛固定后制作成蠟塊進(jìn)行免疫組化染色;另一部分貯存于液氮，用于提取總RNA。U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞由天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)疾病研究所饋贈(zèng)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 細(xì)胞培養(yǎng):U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞在37℃、5%CO2飽和濕度于含10%胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)。隔天換液，每3 d傳代1次。實(shí)驗(yàn)分組:①空白對(duì)照組，僅加入脂質(zhì)體;②無(wú)義序列組，加入無(wú)義序列和脂質(zhì)體;③miR-7轉(zhuǎn)染組:miR-7序列為5'-UUGUUUUAGUGAUCAAGAAGGU-3'。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染:細(xì)胞生長(zhǎng)至60% ～70%匯合時(shí)，降低血清濃度至5%，然后將1 μg的質(zhì)粒與100 μL的LipoVecTM混合20 min后加入培養(yǎng)基中，4 h后換成含20%血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后，用含200 ng/L G418的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，每3 d更換選擇培養(yǎng)液1次。14 d后細(xì)胞集落形成，未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞死亡。待陽(yáng)性細(xì)胞生長(zhǎng)至一定數(shù)量時(shí)，用24孔板進(jìn)行細(xì)胞克隆與傳代擴(kuò)增。

1.3 腦膠質(zhì)瘤組織、U251細(xì)胞中miR-7檢測(cè) 采用RT-PCR法。在冰凍膠質(zhì)瘤組織和空白對(duì)照組、無(wú)義序列組、miR-7轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中利用TRIzol一步法提取總RNA;反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR循環(huán)反應(yīng)。miR-7上游引物:5'-AAAAAGAACACGTGGAAGGATAG-3'，下游引物:5'-CCGCCTAACGTACCGCGAATTT-3'。反應(yīng)條件:94℃、3 min后連續(xù)45個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)內(nèi) 94 ℃、30 s，60 ℃、45 s，72 ℃、30 s。以人18 rRNATaqman探針作為內(nèi)參。目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量=目的條帶的灰度值/同一標(biāo)本內(nèi)參的灰度值。

1.4 腦膠質(zhì)瘤組織中EGFR、PI3K和AKT2蛋白檢測(cè) 采用Envison兩步法。選取石蠟組織塊，連續(xù)切片，厚4 μm，常規(guī)HE染色及免疫組化染色。免疫組化染色步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)立相應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照，PBS液代替一抗作為空白對(duì)照。

1.5 U251 細(xì)胞中 EGFR、PI3K、AKT2 mRNA 和蛋白檢測(cè) 將轉(zhuǎn)染miR-7后的U251細(xì)胞、無(wú)義序列組及空白對(duì)照組分別提取RNA和蛋白，用RT-PCR檢測(cè)EGFR、PI3K、AKT2 mRNA 表達(dá)，方法如下:采用TRIzol一步法提取總RNA，然后利用RT-PCR試劑盒，按說(shuō)明書(shū)詳細(xì)步驟進(jìn)行。采用Western blotting法檢測(cè) EGFR、PI3K、AKT2蛋白表達(dá)，方法如下:U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-7后提取總蛋白，Bradford法蛋白定量。電泳后考馬斯亮藍(lán)染色，蛋白分離滿意后轉(zhuǎn)膜，Western封閉液37℃封閉2 h，PBS充分漂洗后滴加相應(yīng)一抗，抗體稀釋度分別為EGFR(1∶500)、PI3K(1∶500)和AKT2(1∶1 000)，4 ℃水平搖床過(guò)夜，次日使用辣根酶標(biāo)記的1∶500稀釋二抗37℃、2 h?；瘜W(xué)發(fā)光試劑盒顯影，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描光密度值，Quantity One軟件分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用ANOVA單因素方差分析，組間多重比較采用q檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn);miR-7與EGFR/PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路成員之間的相關(guān)性用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦膠質(zhì)瘤組織中miR-7、EGFR/PI3K信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的關(guān)系 miR-7在腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的分別為 1.47±0.27、3.47±0.15，二者比較，P＜0.05。miR-7在WHOⅠ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤組織中分別為 2.12± 0.24、1.97± 0.20、0.96± 0.15、0.55±0.13，Ⅰ、Ⅱ級(jí)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其余兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均＜0.05)。

EGFR、PI3K和AKT2在腦膠質(zhì)瘤中的著色部位均定位在細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)。隨著膠質(zhì)瘤WHO級(jí)別的增加，EGFR、PI3K和AKT2表達(dá)均有不同程度的增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。miR-7與EGFR、PI3K、pAKT在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r分別為 －0.754、－0.528、－0.467，P 均 ＜0.05)。

2.2 U251細(xì)胞中miR-7、EGFR/PI3K信號(hào)通路相關(guān)基因蛋白表達(dá)的關(guān)系 miR-7轉(zhuǎn)染組與空白對(duì)照組、無(wú)義序列組比較，EGFR、PI3K和AKT2的表達(dá)均明顯增加(P均＜0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 U251細(xì)胞中miR-7、EGFR、PI3K、AKT2 mRNA 表達(dá)水平(±s)

表1 U251細(xì)胞中miR-7、EGFR、PI3K、AKT2 mRNA 表達(dá)水平(±s)

注:與空白對(duì)照組、無(wú)義序列組比較，*P＜0.05

組別miR-7 mRNA EGFR mRNA PI3K mRNAAKT2 mRNA miR-7 轉(zhuǎn)染組 2.36±0.18*0.81±0.09*1.01±0.12Δ*0.99±0.10*空白對(duì)照組 0.54±0.09 2.11±0.11 1.98±0.10 1.74±0.14無(wú)義序列組0.68±0.12 2.27±0.13 1.93±0.13 1.71±0.15

3 討論

研究［3，4］表明，膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展與多條基因通路表達(dá)失控密切相關(guān)，調(diào)控基因通路表達(dá)的因子眾多，其中miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)某些基因通路表達(dá)的精細(xì)調(diào)控近年來(lái)倍受關(guān)注。研究［5］表明，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中有多種miRNA的表達(dá)存在差異，其中miR-7是差異最顯著者之一。Kefas等［6］首先報(bào)道在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中出現(xiàn)miR-7低表達(dá)及其可能充當(dāng)抑癌基因角色。本課題組的前期研究［7］發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-7的膠質(zhì)瘤細(xì)胞其增殖細(xì)胞周期及細(xì)胞遷移能力受到明顯抑制。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別的增高，miR-7的表達(dá)呈顯著降低趨勢(shì)，該結(jié)果提示miR-7表達(dá)減少或缺失可能是膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的重要分子事件。

EGFR是一種跨細(xì)胞膜糖蛋白，是酪氨酸激酶受體erbB家族成員。EGFR與配體結(jié)合后，受體酪氨酸激酶自磷酸化，激活下游信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化。該因子突變、擴(kuò)增與過(guò)表達(dá)是惡性膠質(zhì)瘤尤其是原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤早期和主要的分子事件，它通過(guò)下游通路成員推進(jìn)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡、加強(qiáng)端粒酶活性、促進(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤侵襲［8］?；罨腅GFR主要通過(guò)兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑將信息轉(zhuǎn)至細(xì)胞核，一條是ras-raf-MEK-Erk/MAPK途徑，信號(hào)經(jīng)Shc、Grb2傳遞，最后經(jīng)c-jun、cfos傳到核內(nèi);另一條是PI3K-AKT途徑，導(dǎo)致NF-κB移位至核內(nèi)，這種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起核內(nèi)效應(yīng)基因，特別是細(xì)胞周期調(diào)控元件的激活和轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)［9］。

Wang等［10］研究報(bào)道m(xù)iR-7的基因序列與EGFR基因3'-UTR區(qū)存在至少3個(gè)區(qū)域的不完全互補(bǔ)，同時(shí)與EGFR通路成員AKT-2的上游調(diào)節(jié)因子IRS-1和IRS-2的3'-UTR區(qū)存在數(shù)個(gè)片段的不完全互補(bǔ)，通過(guò)抑制EGFR和AKT-2的蛋白質(zhì)表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖抑制作用。我們前期工作發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-7可有效逆轉(zhuǎn)其惡性表型，本實(shí)驗(yàn)對(duì)其調(diào)節(jié)機(jī)制做了進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-7的膠質(zhì)瘤細(xì)胞EGFR/PI3K通路主要成員的表達(dá)受到了明顯的抑制。另外我們又在腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中檢測(cè)miR-7和EGFR/PI3K通路主要成員(EGFR、PI3K、AKT)的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，隨著WHO級(jí)別的增加miR-7表達(dá)呈顯著下降趨勢(shì)，而EGFR、PI3K、AKT表達(dá)則顯著增加，三者與miR-7表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，該結(jié)果與在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的研究結(jié)論基本一致，說(shuō)明EGFR/PI3K通路可能是miR-7調(diào)控膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。

應(yīng)用抗人EGFR單克隆抗體靶向EGFR信號(hào)通路治療惡性腫瘤已經(jīng)成為腫瘤綜合治療新的途徑和熱點(diǎn)。隨著對(duì)miR-7功能研究的不斷深入，越來(lái)越多的證據(jù)表明miR-7可能通過(guò)不同的途徑激活EGFR信號(hào)通路而調(diào)控膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展;miR-7可能成為人腦膠質(zhì)瘤靶向治療的一個(gè)新的研究靶點(diǎn)。

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