張 棟，潘小磊,2，王 尚，關(guān)吉斌，孫 進(jìn)*

（1.沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016; 2.弗吉尼亞州立邦聯(lián)大學(xué) 藥物制劑系，美國 弗吉尼亞州）

RP-HPLC法測定他克莫司聚酸酐納米制劑中他克莫司的含量

張 棟1，潘小磊1,2，王 尚1，關(guān)吉斌1，孫 進(jìn)1*

（1.沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016; 2.弗吉尼亞州立邦聯(lián)大學(xué) 藥物制劑系，美國 弗吉尼亞州）

目的建立他克莫司聚酸酐納米制劑的含量測定方法。方法 采用RP-HPLC法。色譜柱為以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的Kromasil-C18柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm），流動相為乙腈-水（體積比為90:10），流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為216 nm，柱溫為60℃，進(jìn)樣量為20 μL。對3批自制他克莫司聚酸酐納米制劑進(jìn)行含量測定。結(jié)果 他克莫司在 2.0～200.4 mg·L-1內(nèi)與吸收峰面積呈良好的線性關(guān)系 (r=0.999 9)，回歸方程為 A=12 530 ρ-1 641.4，最低定量限為0.5 mg·L-1，平均回收率 (n=9) 為100.1%，RSD為1.18%。3批自制他克莫司聚酸酐納米制劑的含量分別為866.3、876.3、878.3 mg·L-1。結(jié)論 該方法可用于測定他克莫司聚酸酐納米制劑的含量。

藥劑學(xué)；他克莫司；聚酸酐納米制劑；反相高效液相色潽法；含量測定

他克莫司（tacrolimus, 簡稱FK-506）是由日本于1979年在從鏈霉菌株（Streptomyces tssukubaensis）中分離而得的23元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素酵產(chǎn)物，具有強(qiáng)力的免疫抑制作用[1]。他克莫司目前作為一線免疫抑制劑，主要用于降低一些器官移植手術(shù)后患者的免疫排斥反應(yīng)，也可用于一些自身免疫性疾病的治療。上市的他克莫司主要劑型為軟膏劑、膠囊劑和注射劑。關(guān)于前兩者中他克莫司含量測定的方法已有報道[2-3]，但有以下不足：流動相成分復(fù)雜（正己烷-正丁基氯-乙腈）或（乙腈-水-磷酸）以及分析時間長（28 min）等。此外，關(guān)于新劑型他克莫司混懸液中他克莫司含量的測定方法也有報道[4]，該方法對高效液相色譜系統(tǒng)的損耗嚴(yán)重（柱溫：65℃，流速：1.5 mL·min-1），不宜長時間應(yīng)用。他克莫司存在生物利用度低和個體差異顯著的問題，本文作者將其制成聚酸酐納米粒，旨在改善這一情況，并建立了反相高效液相色潽法用于聚酸酐納米粒中他克莫司含量的測定，該方法簡便易行，為納米粒的質(zhì)量控制提供依據(jù)，保證各批次間納米制劑質(zhì)量的一致性，排除進(jìn)一步試驗(yàn)中因制劑因素引入的誤差。他克莫司的結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖 1 他克莫司的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structure of tacrolimus

1 儀器與材料

高效液相色譜儀（配有L-2130泵、L-2400紫外可見檢測器、D-2000 Elite色譜工作站，日立Hitachi公司），Adventurter 電子分析天平（美國Ohaus公司），UV-1800 紫外分光光度計（北京瑞利分析儀器公司），SZ-96 自動純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）。

他克莫司（純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞ 99%，批號為090602，成都川抗萬樂藥業(yè)有限公司），他克莫司聚酸酐納米制劑（自制，批號為 130706-130708），空白聚酸酐納米制劑（自制），乙腈（色譜純，天津康科德化學(xué)試劑公司），水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測波長的選擇

精密稱量他克莫司20.0 mg，置于100 mL 量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，作為他克莫司儲備液。在200～400 nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外波譜掃描，記錄紫外吸收光譜。結(jié)果表明，他克莫司在208 nm 處有最大吸收。但是由于選用溶劑乙腈在此處存在末端吸收，干擾測定，綜合考慮溶劑干擾和檢測靈敏度，選擇216 nm 為液相檢測波長。紫外掃描圖譜見圖2。

圖 2 他克莫司(A)和乙腈(B)的紫外掃描圖Fig. 2 UV-spectrum of tacrolimus (A) and acetonitrile (B)

2.2 色譜條件

色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的Kromasil-C18柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm），流動相：乙腈-水（體積比為90:10），流速：1.0 mL·min-1，檢測波長：216 nm，柱溫：60℃，進(jìn)樣量：20 μL。

理論塔板數(shù)按他克莫司計算應(yīng)不低于2 000，拖尾因子應(yīng)在0.8～1.2內(nèi)。

2.3 對照溶液的制備

精密移取他克莫司儲備液適量于10 mL量瓶中，加溶劑（V（乙腈）:V（水）= 7:3）稀釋至刻度，搖勻，室溫放置3 h后，得到質(zhì)量濃度為60 mg·L-1的對照溶液。

2.4 供試溶液的制備

精密量取他克莫司聚酸酐納米制劑0.5 mL, 置10 mL量瓶中，加溶劑（V（乙腈）:V（水）= 7:3）破乳并稀釋至刻度，搖勻，濾過，室溫放置3 h后，作為供試溶液。

2.5 空白樣品溶液的制備

精密量取空白聚酸酐納米制劑0.5 mL, 置10 mL量瓶中，加溶劑（V（乙腈）:V（水）= 7:3）破乳并稀釋至刻度，搖勻，濾過，室溫放置3 h后，作為空白樣品溶液。

2.6 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取對照溶液20 μL注入液相色譜儀，連續(xù)重復(fù)6次，計算相應(yīng)的理論塔板數(shù)和拖尾因子，結(jié)果見表1。

表1 系統(tǒng)適用性結(jié)果 (n=9)Table 1 Results of system suitability(n=9)

2.7 專屬性考察

分別將對照溶液、供試溶液和空白樣品溶液注入高效液相色譜儀，根據(jù)“2.2”條色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，見圖3。由圖可見，輔料對主藥峰沒有干擾，方法專屬性良好。

圖 3 空白樣品溶液(A)、對照溶液(B)和供試品溶液(C)的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of blank excipient solution (A), tacrolimus standard solution (B) and tacrolimus sample solution (C)

2.8 最低定量下限

取他克莫司儲備液稀釋得到系列他克莫司標(biāo)準(zhǔn)溶液，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。另將溶劑（V（乙腈）:V（水）= 7:3）注入高效液相色譜儀，檢測基線的噪音。將峰高為基線噪聲10 倍的標(biāo)準(zhǔn)溶液的他克莫司濃度作為本方法可測定的最低定量下限，見圖4，最低定量下限為0.5 mg·L-1。

圖 4溶劑（V（乙腈）:V（水）= 7:3）(a)和最低定量下限(b)的色譜圖Fig. 4 Chromatograms of solvent(V(acetonitrile):V(water)=7:3) (a) and lower limit of quantitation (LLOQ) (b)

2.9 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密移取“2.1”條中制得的他克莫司儲備液0.1、0.5、2.0、3.0、5.0、7.5 mL置于10 mL量瓶中，用溶劑（V（乙腈）:V（水）= 7:3）稀釋至刻度，搖勻，制備質(zhì)量濃度分別為2.0、10.0、40.1、60.1、100.2、150.3、200.4 mg·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。室溫放置3 h后，分別取上述溶液20 μL，進(jìn)行測定，記錄色譜峰面積。以測得峰面積A為縱坐標(biāo)，以他克莫司質(zhì)量濃度ρ/ (mg·L-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得到回歸方程：A=12 530 ρ-1 641.4，r=0.999 9。結(jié)果表明，他克莫司在2.0～200.4 mg·L-1內(nèi)與吸收峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.10 精密度試驗(yàn)

取上述濃度為60 mg·L-1的他克莫司標(biāo)準(zhǔn)溶液，室溫放置3 h后，精密量取20 μL注入液相色譜儀，連續(xù)重復(fù)6次，記錄色譜峰面積，計算得到6次峰面積值RSD為1.02%，小于2%。結(jié)果表明，色譜系統(tǒng)儀器精密度良好。

2.11 回收率試驗(yàn)

分別精密稱量他克莫司約8、10、12 mg各3份，置50 mL量瓶中，加入乙腈溶解并稀釋至刻度，得到3個濃度的母液共9份；精密移取上述母液各3 mL分別加入至含有空白聚酸酐納米制劑0.5 mL的10 mL量瓶中，用溶劑（V（乙腈）:V（水）= 7:3）稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為供試樣品。另取質(zhì)量濃度為60 mg·L-1的他克莫司標(biāo)準(zhǔn)溶液作為對照樣品。室溫放置3 h后，分別取供試樣品和對照樣品各20 μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。按外標(biāo)法以峰面積計算樣品濃度，并計算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果見表2。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=9)Table 2 Recoveries of samples（n=9）

2.12 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密移取“2.1”條中制得的他克莫司儲備液適量，分別用溶劑（V（乙腈）:V（水）= 7:3）和純乙腈稀釋得到濃度為60 mg·L-1的他克莫司標(biāo)準(zhǔn)溶液，室溫放置10 h，分別于0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積A，結(jié)果圖5。結(jié)果表明，溶劑（V（乙腈）:V（水）= 7:3）稀釋得到的標(biāo)準(zhǔn)液的峰面積在0～2 h內(nèi)有6%的降低，之后的8 h之內(nèi)峰面積變化率小于2%，而純乙腈稀釋得到的標(biāo)準(zhǔn)液的峰面積在10 h內(nèi)峰面積變化率小于2%，考慮到納米粒溶液中水的存在難以避免，對照溶液應(yīng)使用溶劑（V（乙腈）:V（水）= 7:3）進(jìn)行稀釋并室溫放置3 h后使用，提高測定準(zhǔn)確性。

圖 5 他克莫司在乙腈和溶劑（V（乙腈）:V（水）= 7:3）中的穩(wěn)定性Fig. 5 The stability of tacrolimus in acetonitrile and solvent (V(acetonitrile):V(water)=7:3)

2.13 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取他克莫司聚酸酐納米制劑（批號為130706）0.5 mL，按照“2.4”條制備供試溶液，平行操作6次，按“2.2”條色譜條件分別進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積。計算聚酸酐納米制劑中他克莫司含量的RSD為0.78%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.14 樣品含量測定

精密量取他克莫司聚酸酐納米制劑（批號為130706-130708）各0.5 mL，按照“2.4”條制備供試溶液，平行操作6次，按“2.2”條色譜條件分別進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積。外標(biāo)法計算3批他克莫司聚酸酐納米制劑中藥物的含量，結(jié)果分別為866.3、876.3、878.3 mg·L-1，RSD為0.73%，可見不同批次制得納米制劑的含量幾近相同，質(zhì)量可控。

3 討論與結(jié)論

作者建立了一種可操作性強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)成本低的高效液相色譜法用于他克莫司聚酸酐納米制劑的含量測定，該方法采用簡單的乙腈水二元系統(tǒng)，并將柱溫設(shè)定為60℃，可以保證他克莫司較高的理論塔板數(shù)，提高方法的實(shí)際應(yīng)用價值。對方法的專屬性、最低定量限、線性、精密度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性以及穩(wěn)定性進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，除穩(wěn)定性外，其他考察指標(biāo)均符合要求。由穩(wěn)定性試驗(yàn)可知，水分的存在會導(dǎo)致他克莫司發(fā)生異構(gòu)體轉(zhuǎn)化，使含量降低。但鑒于樣品制備中水的存在難以避免同時選擇乙腈-水（體積比為7:3）做為破乳劑，可以使納米結(jié)構(gòu)充分破壞，藥物釋放完全并全部溶解在溶劑中，減少藥物的損失，因此，最終選擇乙腈-水（體積比為7:3）為溶劑。為降低他克莫司異構(gòu)體轉(zhuǎn)化引入的誤差，要求對照溶液和樣品溶液均需室溫放置3 h后測定，使操作規(guī)范化，可有效地控制他克莫司聚酸酐納米制劑的質(zhì)量。

[1] BOWMAN L J, BRENNAN D C. The role of tacrolimus in renal transplantation [J]. Expert Opin Pharmacother, 2008, 9 (4): 635-643.

[2] 李國輝, 李磊, 張厚才, 等. HPLC檢測他克莫司軟膏劑中他克莫司的含量[J]. 成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2011, 6(2): 150-152.

[3] 劉冰冰, 朱克旭. HPLC法測定他克莫司膠囊的含量[J]. 安徽醫(yī)藥, 2008, 12(8): 693-694.

[4] LABBERTON L, HERDER R E, BOLHUIS M S. Formulation of a tacrolimus suspension with an extended expiry date in a hospital pharmacy [J]. Practice Research & Innovation, 2011, 7(6): 36-40.

Determination of content of tacrolimus in polyanhydride nanoparticles by RP-HPLC

ZHANG Dong1, PAN Xiao-lei1,2, WANG Shang1, GUAN Ji-bin1, SUN Jin1*
(1. School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China; 2. Department of Pharmaceutics, Virginia Commonwealth University, Virginia, USA)

ObjectivesTo establish an RP-HPLC method for the determination of tacrolimus in polyanhydride nanoparticles. Methods RP-HPLC method was adopted. Kromasil-ODS (250 mm×4.6 mm, 5 μm）column was used. The mobile phase consisted of acetonitrile-water (V:V=90:10). The flow rate was1.0 mL·min-1and the detection wavelength was set at 216 nm. The column temperate was 60℃. The sample volume was 20 μL. The contents of tacrolimus in 3 batches polyanhydride nanoparticles were determined. Results Good linear correlation (r=0.999 9) between peak areas (A) and concentration (ρ) of tacrolimus ranging from 2.0 to 200.4 mg·L-1was obtained, and the calibration curve was A=12 530 ρ-1 641.4. The lower limit of quantitation (LLOQ) for tacrolimus was 0.5 mg·L-1. The average recovery was 100.1% (n=9) and RSD was 1.18%. The contents of tacrolimus in 3 batches of polyanhydride nanoparticles were 866.3，876.3，878.3 mg·L-1, respectively. Conclusions RP-HPLC method established here was competent for the assay of tacrolimus in polyanhydride nanoparticles.

pharmaceutics; tacrolimus; polyanhydride nanoparticles; RP-HPLC; content determination

R94

A

（2014）01–0010–07

(本篇責(zé)任編輯：呂向一)

2013–12–16

張棟(1988-), 男(漢族), 遼寧海城人, 碩士研究生, E-mail zhangdong328@126.com；＊通訊作者：孫進(jìn)(1975-), 男(漢族), 安徽金寨人, 教授, 主要從事藥劑學(xué)研究, Tel. 024-23986325, E-mail sunjin66@21cn.com。