菊花總黃酮對(duì)去勢(shì)導(dǎo)致雄兔干眼癥淚腺細(xì)胞Bax、Bcl-2表達(dá)的影響

姚小磊，彭清華，陳啟雷，唐勇華，鐘 茜

（1．廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011；

2．湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)眼科學(xué)重點(diǎn)學(xué)科，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

菊花總黃酮對(duì)去勢(shì)導(dǎo)致雄兔干眼癥淚腺細(xì)胞Bax、Bcl-2表達(dá)的影響

姚小磊1，彭清華2，陳啟雷1，唐勇華1，鐘 茜1

（1．廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011；

2．湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)眼科學(xué)重點(diǎn)學(xué)科，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

目的 觀察菊花總黃酮對(duì)去勢(shì)所致干眼癥白兔淚腺凋亡相關(guān)基因蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)的影響，探討菊花總黃酮治療干眼癥的作用機(jī)制。方法 將150只雄性日本大耳白兔隨機(jī)分為正常組（A組）、假手術(shù)組（B組）、模型組（C組）、雄激素對(duì)照治療組（D組）和菊花總黃酮治療組（E組）。分別于治療后1、3和5個(gè)月每組處死10只，取材用于相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。C組、D組、E組行雙側(cè)去勢(shì)術(shù)建立白兔干眼癥模型。E組白兔用菊花總黃酮灌胃治療，D組用雄激素肌肉注射，A組、B組、C組用生理鹽水灌胃。全部白兔行SchirmerⅠ實(shí)驗(yàn)，并檢測(cè)淚膜破裂時(shí)間，處死后取淚腺組織，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)淚腺組織中凋亡相關(guān)基因蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)，并計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果 E組SchirmerⅠ實(shí)驗(yàn)測(cè)量所得濾紙濕長(zhǎng)明顯高于C組（P＜0.01），淚膜破裂時(shí)間明顯長(zhǎng)于C組（P＜0.01）。E組治療1、3和5個(gè)月后，淚腺導(dǎo)管及腺泡上皮細(xì)胞中Bax陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)均明顯低于C組，Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)均明顯高于C組，細(xì)胞凋亡數(shù)量均明顯低于C組（P＜0.01）。結(jié)論 菊花總黃酮中主要成分為黃酮類物質(zhì)，可顯著抑制雄激素水平降低后白兔干眼癥的發(fā)生，抑制淚腺細(xì)胞凋亡，維持淚腺基礎(chǔ)分泌量和淚膜的穩(wěn)定性。

干眼癥已成為目前眼科研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。雄激素水平下降是干眼癥的重要發(fā)病原因，已逐漸成研究熱點(diǎn)。菊花有效部位為黃酮類物質(zhì)[1]。雄激素、黃酮均為雜環(huán)多酚類化合物，目前研究已證明某些黃酮類化合物具有擬雄激素作用[2]，可以用于治療因雄激素水平下降所致的疾病[3]。利用放射性示蹤標(biāo)記的方法研究還表明，黃酮是細(xì)胞雄激素受體（androgen receptor，AR）的刺激物，可以與細(xì)胞AR結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[4]。我們因此提出假說(shuō)：菊花中所含黃酮也應(yīng)該可與AR結(jié)合，產(chǎn)生擬雄激素效應(yīng)，治療雄激素水平下降導(dǎo)致的干眼癥。因此我們制備菊花總黃酮，并制作去勢(shì)白兔干眼癥模型進(jìn)行研究，旨在探討菊花總黃酮對(duì)抗雄激素水平下降所致干眼癥的治療效果以及是否能夠抑制淚腺組織的細(xì)胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 取健康2月齡雄性日本大耳白兔150只 （上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，SPF級(jí)，許可證號(hào)：2012-0361，遠(yuǎn)交系），體質(zhì)量2.0~2.5 kg。裂隙燈顯微鏡、眼底鏡檢查眼前節(jié)及眼底無(wú)異常，0.5%的卡因眼液表面麻醉后SchirmerⅠ試驗(yàn)（SchirmerⅠ test，SIT）檢測(cè)5 min≥10 mm和淚膜破裂時(shí)間（break up time，BUT）≥10 s檢查的白兔方可使用。

1.1.2 藥物 菊花總黃酮，由浙江大學(xué)蘇州工業(yè)技術(shù)研究院生產(chǎn)（批號(hào)：JH130804）。

1.1.3 試劑 蘆丁對(duì)照品 （蘆丁≥98%；批號(hào)：MUST-12040302成都曼斯特生物科技有限公司）。5%BSA封閉液，兔抗兔Bax、Bcl-2多克隆抗體，生物素化山羊抗兔IgG（FITC-IgG），過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈酶白卵素（atrept avidin-biotin complex，SABC）免疫組織化學(xué)試劑盒，3，3-二氨基聯(lián)苯胺 （3’，3-diaminobenzidine，DAB）顯色劑（均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司）。

1.1.4 儀器及設(shè)備 TU-1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；EYELA SB-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司）；DLSB-5/20低溫冷卻液循環(huán)泵 （鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；AL-204電子天平 （METTER TOLEDO公司）LEICA DM LB2型雙目顯微鏡 （德國(guó)LEICA公司生產(chǎn)）；Shandon325型石蠟切片機(jī) （英國(guó)Shandon公司生產(chǎn)）；DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 （上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)）；Motic B5顯微攝像系統(tǒng)（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司生產(chǎn)）；MIAS-1000型高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 菊花總黃酮的制備 菊花有效部位的提取方法：首先對(duì)乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度和提取次數(shù)進(jìn)行單因素考察，并通過(guò)正交優(yōu)化設(shè)計(jì)，尋求了醇提最佳工藝條件；再通過(guò)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)、動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化出純化杭白菊總黃酮的良好大孔樹脂以及最佳吸附條件、洗脫條件。杭白菊干燥花蕾15 kg粉碎后，醇提2次（第1次：原藥材浸泡10倍量80%乙醇，加熱至80℃提取2 h，過(guò)濾；第2次：第1次提取的藥渣浸泡8倍量的80%乙醇，加熱80℃提取1 h），濃縮后水沉，離心過(guò)濾，濾液上AB-8大孔樹脂柱，用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫液濃縮，經(jīng)真空帶式干燥后粉碎得總黃酮干粉。

1.2.2 動(dòng)物分組 對(duì)此150只雄兔，采用隨機(jī)數(shù)字法分為A1、B1、C1、D1、E1、A3、B3、C3、D3、E3、A5、B5、C5、D5、E5共15組，每組10只。其中：A代表：正常組；B代表：假手術(shù)組；C代表：模型對(duì)照組；D代表：雄激素對(duì)照治療組；E代表：菊花總黃酮治療組；1、3、5分別代表藥物干預(yù)1、3、5個(gè)月，見(jiàn)表1。

表1 動(dòng)物雄兔分組表

1.2.3 雄激素水平下降導(dǎo)致干眼癥動(dòng)物模型的制作 參照作者前期研究的方法[5]，行雙側(cè)睪丸切除術(shù)（ORX）：將C、D、E 3組實(shí)驗(yàn)兔切除雙側(cè)睪丸及附睪。B組只切開陰囊，不切除睪丸，作為假手術(shù)對(duì)照。

1.2.4 給藥方法 各組在造模后1周，待傷口基本愈合后開始用藥。菊花總黃酮的灌胃劑量和丙酸睪酮注射量均按成人常用劑量，通過(guò)體表面積換算方法進(jìn)行計(jì)算 （白兔以2 kg體質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)，人以60 kg體質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)）。A、B、C組以0.9%生理鹽水5 000 mg/kg灌胃，1次/d；D組丙酸睪酮注射液以1∶4麻油稀釋后按500 mg/kg大腿肌肉注射，1次/3 d；E組以1%菊花總黃酮生理鹽水混懸液 （即10 mL生理鹽水中溶菊花總黃酮63.6 mg），5 g/kg灌胃（通過(guò)體表面積換算，按60 kg的成人每天服用30 g菊花原藥材計(jì)算），1次/d。

1.2.5 STU和BUT檢查 取材前先完成基礎(chǔ)分泌量、淚膜穩(wěn)定性測(cè)定 分別于分組前、末次給藥完成后對(duì)此150只雄兔分別于進(jìn)行SIT和BUT檢查，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)參照SIT與BUT的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。SIT測(cè)定參照有關(guān)文獻(xiàn)[7]。正常濾紙大小 （5 mm×35 mm）的Whatmean 41號(hào)濾紙條，將一端折彎5 mm，置于下瞼內(nèi)側(cè)1/3結(jié)膜囊內(nèi)，其余部分懸垂于皮膚表面。人工使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物閉眼，5 min后測(cè)量濾紙濕潤(rùn)長(zhǎng)度（不包括反折）。BUT測(cè)定：用玻璃棒蘸2%熒光素鈉溶液在下瞼結(jié)膜囊內(nèi)涂抹，使眼瞼閉合熒光素均勻分布于角膜表面后，固定其上下瞼使角膜充分暴露，于裂隙燈下用鉆藍(lán)光照射觀察，從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物瞬目后睜眼開始計(jì)時(shí)，記錄淚膜上出現(xiàn)第一個(gè)破裂點(diǎn)的時(shí)間。

1.2.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)方法 SIT和BUT檢查完后立即以斷頭法處死動(dòng)物，即刻摘除淚腺。予以4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，供免疫組織化學(xué)方法使用。每組石蠟塊予以石蠟切片機(jī)連續(xù)切片，脫蠟至水，蒸餾水洗滌2 min×2次。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作。顯微鏡下觀察淚腺組織中淚腺導(dǎo)管細(xì)胞及腺泡上皮細(xì)胞的細(xì)胞凋亡以及免疫組化染色情況。Motic B5顯微攝像系統(tǒng)進(jìn)行攝像并經(jīng)免疫組織化學(xué)測(cè)量系統(tǒng)以2.105 μm為像素點(diǎn)長(zhǎng)，在1.271×106μm2窗口面積下測(cè)量凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2蛋白的平均光密度值，行半定量分析。并隨機(jī)統(tǒng)計(jì)各組5~7個(gè)高倍視野(×400倍)中的凋亡細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算每高倍視野下的平均細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)性意義。資料用“±s”表示。先進(jìn)行正態(tài)分布及方差齊性檢驗(yàn)，若呈正態(tài)分布，方差齊，多組比較采用方差分析，治療后多組比較，以治療前數(shù)值為協(xié)變量，進(jìn)行協(xié)方差分析，治療前后比較用配對(duì)t檢驗(yàn)，方差不齊者進(jìn)行Satterthwaite方法進(jìn)行校正t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 菊花總黃酮提取質(zhì)控結(jié)果

菊花藥材15 kg提取，得到成品300 g。紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定提取物中總黃酮的含量：用已經(jīng)制備的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照液作為對(duì)照，建立紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率實(shí)驗(yàn)，紫外法測(cè)定成品中總黃酮含量。成品中總黃酮含量達(dá)73.5%，收率為4.9%，總黃酮的提取率為42.1%。

2.2 基礎(chǔ)淚液分泌量

SIT檢測(cè)基礎(chǔ)淚液分泌量，經(jīng)自身前后配對(duì)t檢驗(yàn)顯示，C1、C3、C5組白兔去勢(shì)后基礎(chǔ)淚液分泌量明顯減少，與去勢(shì)前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P< 0.01）。方差分析顯示，與C1組比較，C3和C5組白兔的淚腺分泌量下降（P<0.05，P<0.01）。

E組SIT值與相同時(shí)間點(diǎn)的C組比較，以治療前的SIT值為協(xié)變量，經(jīng)協(xié)方差分析，E組基礎(chǔ)淚液分泌量增加，濾紙濕長(zhǎng)明顯增長(zhǎng)（P<0.01）。見(jiàn)表2。

2.3 淚膜穩(wěn)定性

BUT檢測(cè)模型組淚膜穩(wěn)定性，經(jīng)自身前后配對(duì)t檢驗(yàn)顯示，C1、C3、C5組BUT明顯縮短，與去勢(shì)前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；方差分析顯示，與C1組比較，C5組白兔的BUT更短 （P< 0.05）。

E組在不同治療時(shí)間后比較，E5組的淚膜穩(wěn)定性較E1組降低（P<0.05），其他各時(shí)間點(diǎn)之間BUT值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。以治療前的淚膜破裂時(shí)間為協(xié)變量，經(jīng)協(xié)方差分析，治療組淚膜穩(wěn)定性增加，BUT與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)模型組比較明顯延長(zhǎng)（P<0.01）。見(jiàn)表3。

表2 白兔各組治療前后SIT測(cè)量值 （±s，mm，n=10）

表2 白兔各組治療前后SIT測(cè)量值 （±s，mm，n=10）

注：與同組給藥前比較**P<0.01；與給藥1個(gè)月組比較△P<0.05，△△P<0.01；與同時(shí)期模型（C）組比較##P<0.01。下表同。

組別A組 給藥前給藥后B組 給藥前給藥后C組 給藥前給藥后D組 給藥前給藥后E組 給藥前給藥后1個(gè)月后15.3±5.7 15.5±5.9 15.0±5.7 15.4±6.0 13.4±2.3 6.7±2.3** 13.2±2.3 13.0±2.3 13.4±3.3 14.7±5.3##3個(gè)月后14.8±5.2 15.3±5.0 14.8±5.3 15.1±5.0 15.5±4.3 4.7±1.0**△15.0±4.3 15.7±4.6 14.7±3.7 13.3±5.7##5個(gè)月后15.3±4.2 16.1±6.0 15.3±4.8 15.1±4.9 14.5±3.1 2.7±2.0**△△15.6±3.4 14.9±4.2 14.5±3.0 12.7±5.2##

表3 白兔各組治療前后BUT測(cè)量值 （±s，s，n=10）

表3 白兔各組治療前后BUT測(cè)量值 （±s，s，n=10）

組別A組 給藥前給藥后B組 給藥前給藥后C組 給藥前給藥后D組 給藥前給藥后E組 給藥前給藥后1個(gè)月后14.3±3.2 14.5±2.6 14.3±3.3 14.6±2.6 13.6±1.8 7.4±1.1** 13.2±1.0 12.2±1.1 14.6±2.8 14.9±4.4##3個(gè)月后15.3±0.3 14.1±6.0 15.1±3.3 14.0±6.1 14.5±4.1 6.7±2.3** 14.7±4.2 13.8±2.8 14.6±2.2 12.8±2.7##5個(gè)月后14.8±5.7 15.3±4.4 14.8±5.8 15.3±4.4 13.5±4.1 4.7±2.1**△13.1±4.2 13.7±2.4 13.8±1.7 11.8±4.4##△

2.4 淚腺細(xì)胞凋亡

C1、C2、C3組去勢(shì)后細(xì)胞凋亡明顯增強(qiáng)，淚腺腺泡和導(dǎo)管上皮中均可見(jiàn)散在的陽(yáng)性凋亡細(xì)胞，與相應(yīng)的A組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與C1組比較，C5組的淚腺細(xì)胞凋亡數(shù)量增加 （P< 0.05）。光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)凋亡細(xì)胞核呈棕黃色，有的細(xì)胞核中染色物質(zhì)集中于核膜下呈不規(guī)則環(huán)形或半月形，或可見(jiàn)分裂的細(xì)胞核。E1、E2、E3組的細(xì)胞凋亡數(shù)量下降，與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表4。

A組、B組Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)不明顯。C組淚腺導(dǎo)管和腺泡中可見(jiàn)大量Bax蛋白表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中，呈棕黃色顆粒，而Bcl-2表達(dá)不明顯。治療組Bax表達(dá)較相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)模型組減弱，Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)，可見(jiàn)其大量表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中，呈棕黃色顆粒。見(jiàn)表4和圖1、2（第64頁(yè)彩圖）。

表4 各組治療后淚腺組織中Bax、Bcl-2表達(dá)及細(xì)胞凋亡情況（±s，n=10）

表4 各組治療后淚腺組織中Bax、Bcl-2表達(dá)及細(xì)胞凋亡情況（±s，n=10）

注：與給藥1個(gè)月組比較△P<0.05，△△P<0.01；與同時(shí)期正常組比較▲▲P<0.01；與同時(shí)期模型（C）組比較##P<0.01。與C1組比較*P<0.05。

Group A組 1個(gè)月后3個(gè)月后5個(gè)月后B組 1個(gè)月后3個(gè)月后5個(gè)月后C組 1個(gè)月后3個(gè)月后5個(gè)月后D組 1個(gè)月后3個(gè)月后5個(gè)月后E組 1個(gè)月后3個(gè)月后5個(gè)月后Bax光密度值0.082±0.010##0.084±0.024##0.086±0.028##0.079±0.011##0.085±0.018##0.084±0.018##0.441±0.094 0.561±0.048 0.497±0.047 0.141±0.091##0.166±0.158##0.144±0.073##0.156±0.021##0.176±0.066##0.188±0.013##△Bcl-2光密度值0.114±0.027 0.124±0.014 0.163±0.024 0.115±0.014 0.125±0.024 0.095±0.065 0.174±0.044 0.145±0.055 0.172±0.021 0.505±0.114##0.495±0.024##0.425±0.065##0.411±0.104##0.499±0.094##0.533±0.076##△△凋亡細(xì)胞數(shù)量12.34±4.67 13.01±5.55 12.87±3.22 15.31±4.07 15.04±5.50 13.87±4.02 46.45±9.27▲▲59.23±10.32▲▲71.41±11.68▲▲* 11.78±3.91##20.27±4.89##30.89±5.67##12.27±3.21##21.28±4.09##31.88±5.60##

3 討論

3.1 中醫(yī)對(duì)于菊花及相關(guān)方劑治療干眼癥的佐證論述

干眼癥根據(jù)其癥狀，輕癥可歸屬于“白澀癥”，重癥可歸屬于“神水將枯”?！睹貍餮劭讫埬菊摗氛撌觯骸澳繚吆我?？答曰：此乃熏臟腑也……液道枯干，臟腑邪熱傳于衛(wèi)，真氣不榮于目，故目澀也。依用羊肝丸?！保ㄋd“羊肝丸”第一味藥即菊花）可見(jiàn)“神水將枯”病機(jī)為內(nèi)因在臟腑之邪熱傷陰液，邪熱傳于衛(wèi)表則為風(fēng)熱。而《素問(wèn)·宣明五氣篇》說(shuō)：“五臟化液，肝為淚”，《銀海精微》說(shuō)：“淚乃肝之液”，可見(jiàn)“神水將枯”所病臟腑在肝，所以治療原則應(yīng)在內(nèi)清肝熱、養(yǎng)肝陰，在外清肺衛(wèi)風(fēng)熱。

菊花入肝經(jīng)，既能清肝，又能養(yǎng)肝，還可入肺經(jīng)，清肺衛(wèi)風(fēng)熱[8]，為治療干眼癥理想藥物。《銀海精微》、《原機(jī)啟微》、《眼科龍目論》、《目經(jīng)大成》 等所收錄的許多治療干眼癥癥狀的代表方劑，如秘方菊花散方、菊花散、蟬花散、菊睛丸、五秀重明丸、白菊清金散等，以及《審視瑤函》中治療“白澀癥”的桑白皮湯，方中皆有菊花，且大都為君藥；特別是《眼科龍目論》說(shuō)“菊花散，理肝氣風(fēng)毒、眼目赤腫、昏暗羞明、隱澀難開”，《銀海精微》說(shuō)“蟬花散，治肝經(jīng)蘊(yùn)積、熱毒傷肝、上攻于目”，《原機(jī)啟微》說(shuō)“五秀重明丸，治翳膜遮睛、癮澀昏花”，都體現(xiàn)了菊花治療干眼癥的重要性?？梢?jiàn)菊花在內(nèi)可清肝之積熱，滋肝之陰液，在外清衛(wèi)表風(fēng)熱，為治療干眼癥的理想藥物，具有良好的中醫(yī)理論依據(jù)。

3.2 雄激素水平下降將引起淚腺局部細(xì)胞凋亡

正常淚腺極少發(fā)生細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，而在干眼癥患者和動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)結(jié)膜上皮細(xì)胞和淚腺腺泡細(xì)胞的凋亡增加[9-10]。大量研究證實(shí)[11]，Bcl-2基因產(chǎn)物具有明顯抑制細(xì)胞凋亡的作用，可延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，增加細(xì)胞數(shù)目。Bax蛋白可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，對(duì)抗Bcl-2蛋白抑制細(xì)胞凋亡的作用[12]。

研究發(fā)現(xiàn)[13]，應(yīng)用雄激素后，除使兔淚腺腺體中淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯減輕的同時(shí)，淚腺中的Bax mRNA也明顯減少，而 Bcl-2、c-myb、及AR mRNA都明顯增加。另外，Azzarolo等[14]研究還發(fā)現(xiàn)雄激素有防止淚腺細(xì)胞凋亡、壞死和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的作用。這說(shuō)明雄激素水平高低與干眼癥的淚腺細(xì)胞凋亡和炎癥之間有密切的關(guān)系。

3.3 菊花提取物對(duì)淚腺局部細(xì)胞凋亡的影響

雄激素水平下降是干眼癥發(fā)生的一個(gè)重要原因，雄激素替代治療是有明確療效的，但是長(zhǎng)期使用雄激素將會(huì)導(dǎo)致一系列相應(yīng)副作用的發(fā)生。目前研究已證明某些黃酮類化合物具有擬雄激素作用[2]，有望成為雄激素替代藥物，以規(guī)避雄激素的副作用[3]。在作者參與的同類研究中，就發(fā)現(xiàn)密蒙花總黃酮灌胃，對(duì)于雄激素水平下降的動(dòng)物模型有較好的實(shí)驗(yàn)療效[15-16]，并且可以抑制淚腺組織的細(xì)胞凋亡[17]，使大鼠淚腺中 Bcl-2 mRNA表達(dá)增加，降低Bax mRNA的表達(dá)，但隨病程的延長(zhǎng)其作用弱于雄激素[18]，為本研究提供了很好的借鑒作用。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，D1、D3、D5組以及E1、E3、E5組淚腺組織中的Bax平均光密度值較C1、C3、C5組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)；D1、D3、D5組以及E1、E3、E5組淚腺組織中的Bcl-2平均光密度值較C1、C3、C5組增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P< 0.01)，說(shuō)明促凋亡因子Bax在淚腺局部受到雄激素和菊花總黃酮的抑制，而抑凋亡因子Bcl-2在淚腺局部受到雄激素和菊花總黃酮的激活，菊花總黃酮的效應(yīng)與雄激素類似，與同類研究結(jié)果有一致性[18]；但隨著時(shí)間的推移，菊花總黃酮對(duì)凋亡因子的影響開始遜于雄激素，D5組與E5組之間的差異開始有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)菊花總黃酮的擬激素效應(yīng)逐漸適應(yīng)有關(guān)，可考慮進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)研究表明，通過(guò)菊花總黃酮的干預(yù)，抑制了細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為治療組淚腺組織中Bcl-2表達(dá)顯著提高，而Bax顯著降低，因此淚腺局部的細(xì)胞凋亡數(shù)量減少，正常淚腺細(xì)胞得到保護(hù)，使處于凋亡階段的細(xì)胞退出凋亡程序。對(duì)于雄性去勢(shì)白兔來(lái)說(shuō)，這可能與菊花總黃酮發(fā)揮了雄激素替代作用相關(guān)，與Toda等[13]的實(shí)驗(yàn)中雄激素能夠提高淚腺局部Bcl-2表達(dá)而抑制Bax表達(dá)的結(jié)果相符合。正常淚腺細(xì)胞得到保護(hù)之后，淚液分泌得到保障，表現(xiàn)為淚液基礎(chǔ)分泌量試驗(yàn)以及淚膜破裂時(shí)間測(cè)量值的好轉(zhuǎn)，使E組SIT、BUT接近A組。

根據(jù)本研究結(jié)果，我們認(rèn)為菊花總黃酮可以抑制淚腺腺泡和腺管細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，提高淚液基礎(chǔ)分泌量，維持淚膜穩(wěn)定性，改善眼表干燥狀態(tài)，其機(jī)制可能與菊花總黃酮的擬雄激素效應(yīng)有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

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（本文編輯 楊 瑛）

Effects of Total Flavonoids of Chrysanthemum on Bax and Bcl-2 Expressions of Lacrimal Gland Cells Apoptosis of Castrated Rabbits with Dry Eye

YAO Xiaolei1,PENG Qinghua2,CHEN Qilei1,TANG Yonghua1,ZHONG Qian1
（1.Ruikang Affiliated Hospital of Guangχi University of Chinese Medicine,Nanning,Guangχi 530011,China;2.Key Discipline of Ophthalmology of Chinese Medicine,the First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China）

Objective To evaluate the effects of the total flavonoids of chrysanthemum onbasic tears secretory volume,tear film stability,expressions of Bax and Bcl-2 of castrated rabbits with dry eye,and investigate the therapeutic effects of the total flavonoids on dry eye caused by gonadal hormones level imbalance.Methods 150 rabbits were divided into blank group(group A),sham-operated group (group B),untreated group (group C),androgen group (control treatment group,group D),and total flavonoids of chrysanthemum group (treatment group,group E).The dry eye models were established with orchiectomy on the group C,group D and group E.Rabbits in the group E were treated with total flavonoids of chrysanthemum.Rabbits in the group D were treated with androgen intramuscular injection.Rabbits in the group A,group B and group C weretreated with normalsaline.Allrabbitsweredetected with SchirmerⅠexperimentand the tearbreak-up time (BUT)was evaluated fordry eye.Bax,Bcl-2 were checked on immunohistochemistry. Results The Schirmer's I test values of the treatment group was significantly higher than that of the untreated group(P<0.01)and the BUT value of the treatment group was significantly longer than that of the untreated group(P<0.01). The quantity of expression of Bax in acinar epithelial cell and glandular tube cell of the treatment group were significantly higher than that of the untreated group(P<0.01)and the expression of Bcl-2 in acinar cell and glandular tube cell of the treatment group were also significantly higher than that of the untreated group(P<0.01).Conclusion The main components of chrysanthemum are the flavonoids,which could significantly inhibit the syndrome of dry eye in rabbit after androgen level lowered and lacrimal gland apoptosis and keep basic tears secretory volume and tear film stability.

castrate;dry eye;lacrimal gland;apoptosis;total flavonoids of chrysanthemum

R285.5；R777.2

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.07.003.012.06

2014－05－21

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)基金項(xiàng)目（81260550）；廣西壯族自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2012GXNSFBA053092）；廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目（GZPT1221）。

姚小磊，男，醫(yī)學(xué)博士，講師，主治醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療眼表疾病、眼底病。

〔關(guān)鍵詞〕去勢(shì)；干眼癥；淚腺；細(xì)胞凋亡；菊花總黃酮