劉友平，劉 田，畢 航，張 磊，黨永輝

(1.西安交通大學(xué)宗濂書院，2.西安交通大學(xué)啟德書院，3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710061)

品系、性別和生物節(jié)律對(duì)小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的影響

劉友平1，劉 田2，畢 航2，張 磊1，黨永輝3

(1.西安交通大學(xué)宗濂書院，2.西安交通大學(xué)啟德書院，3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710061)

目的探討性別、品系以及晝夜生物節(jié)律對(duì)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的影響。方法利用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同性別的C57BL/6、BALB/c、昆明小鼠在白天與夜間對(duì)新環(huán)境的探索行為與自發(fā)活動(dòng)能力。結(jié)果3種品系小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：C57BL/6在曠場(chǎng)中探索活動(dòng)和自發(fā)活動(dòng)量最低，顯著低于BALB/c和昆明小鼠；C57BL/6雌、雄小鼠在白天和夜晚探索活動(dòng)和自發(fā)活動(dòng)量未見差異，而BALB/c和昆明小鼠分別在白天和夜間呈現(xiàn)性別差異；C57BL/6雌雄小鼠晝夜探索活動(dòng)和自發(fā)活動(dòng)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而BALB/c和昆明雌性小鼠呈現(xiàn)夜間高于白天，雄性小鼠則無此表現(xiàn)。結(jié)論C57BL/6小鼠在新環(huán)境中探索活動(dòng)少，自發(fā)活動(dòng)量低，且受性別、節(jié)律因素影響較小，適合用于神經(jīng)行為學(xué)和焦慮相關(guān)行為研究。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)；探索行為；自發(fā)活動(dòng)；品系；性別；生物節(jié)律；神經(jīng)行為學(xué)；BALB/c小鼠；C57BL/6小鼠；昆明小鼠

小鼠(Mus musculus)是廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、生理心理學(xué)和神經(jīng)精神藥物學(xué)等研究領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一［1］，根據(jù)其基因純合程度?？煞譃榻幌?inbred strain)和封閉群(closed colony)兩類［2］。按照我國《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物哺乳類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳質(zhì)量控制》標(biāo)準(zhǔn)，近交系小鼠是指連續(xù)20代以上的全同胞兄妹或親子交配培育而成，品系內(nèi)所有個(gè)體都可追溯到起源于第20代或以后代數(shù)的一對(duì)共同祖先的遺傳群；封閉群小鼠則是指以非近親交配方式進(jìn)行繁殖生產(chǎn)的一個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種群，在不從外部引入新個(gè)體的條件下，至少連續(xù)繁殖4代以上的群體［2-3］。近交系常見品系有C57BL/6、BALB/c等，封閉群常見有昆明、ICR等品系小鼠［2］。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open field test，OFT)，也稱敞箱實(shí)驗(yàn)、空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)，是評(píng)價(jià)嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能［4］和焦慮狀態(tài)［5］的經(jīng)典行為學(xué)方法，被廣泛運(yùn)用于精神神經(jīng)藥理學(xué)、神經(jīng)行為學(xué)等的基礎(chǔ)研究［5-6］。其原理基于嚙齒類動(dòng)物同時(shí)有畏懼空曠場(chǎng)地和探究新事物、新環(huán)境的天性［7］，因此在一個(gè)開闊的場(chǎng)地中其活動(dòng)呈現(xiàn)趨避性(phobotaxis)［8］。一般認(rèn)為在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物沒有事先熟悉敞箱的情況下，記錄到的曠場(chǎng)活動(dòng)前10～20 min以探究活動(dòng)為主，后30～40 min主要反映自發(fā)活動(dòng)［9］。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)受到諸多因素的影響，諸如動(dòng)物遺傳變異［10］、性別、實(shí)驗(yàn)環(huán)境［11］、晝夜節(jié)律、動(dòng)情周期等［12］。

為研究曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)主要指標(biāo)所受實(shí)驗(yàn)條件的影響，本文通過研究不同性別、不同品系(昆明、C57BL/6和BALB/c)小鼠在不同測(cè)試時(shí)間(早、晚)曠場(chǎng)活動(dòng)中的表現(xiàn)，深入探討品系、性別和生物節(jié)律對(duì)小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物昆明、C57BL/6、BALB/c小鼠各32只，雌雄各半，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)已獲西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)，并按動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理?xiàng)l例進(jìn)行小鼠飼養(yǎng)和管理。同品系同性別小鼠每4只隨機(jī)同籠飼養(yǎng)。小鼠按性別、品系分別進(jìn)行隨機(jī)分組，每8只分為1組，以K、C、B分別代表昆明、C57BL/6、BALB/c各品系，F(xiàn)、M代表雌、雄，D、N代表白天、夜間，共分為KFD、KFN、KMD、KMN、CFD、CFN、CMD、CMN、BFD、BFN、BMD、BMN共12組(n=8)，各組間小鼠體質(zhì)量經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)未見差異。飼養(yǎng)條件：室溫(23±1)℃；濕度(50 ±5)%；日光燈采光，光暗周期12/12(光照時(shí)間為7∶00～19∶00)；動(dòng)物自由獲取水和食物。

1.2 儀器設(shè)置采用計(jì)算機(jī)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分析系統(tǒng)SMART VIDEO-TRACKING(美國、SMARTv3.0.02)。該儀器主要由4個(gè)40 cm×40 cm×40 cm實(shí)驗(yàn)敞箱組成，箱子頂部中央安置有與記錄系統(tǒng)相連接的攝像機(jī)，通過系統(tǒng)分析小鼠實(shí)時(shí)圖像以獲得小鼠在曠場(chǎng)中的行為數(shù)據(jù)。

1.3 OFT實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前將各品系小鼠在飼養(yǎng)室適應(yīng)1周，在此期間每天抓摸動(dòng)物5 min左右使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)者的操作。實(shí)驗(yàn)開始前30 min將小鼠移入測(cè)試室適應(yīng)，以保證實(shí)驗(yàn)時(shí)小鼠活動(dòng)趨于穩(wěn)定。測(cè)試時(shí)間：白天為8∶30～11∶30，夜間為20∶30～23∶30。實(shí)驗(yàn)前選擇SMART系統(tǒng)中的曠場(chǎng)模式并進(jìn)行模式指標(biāo)設(shè)定，將記錄時(shí)間設(shè)置為1 h，調(diào)節(jié)亮度等參數(shù)，將小鼠背對(duì)操作者放入曠場(chǎng)中央，鍵入“開始”命令后開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)記錄。每只動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后清除敞箱底板糞便，用500 m L/L乙醇噴灑敞箱底部并用潔凈紗布抹干，以避免前次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的殘留氣味影響本次實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束獲得實(shí)驗(yàn)軌跡數(shù)據(jù)后，利用SMART系統(tǒng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得1 h內(nèi)的每10 min路程距離、總路程距離、前10 min進(jìn)入中央?yún)^(qū)域次數(shù)等數(shù)據(jù)。以前10 min實(shí)驗(yàn)反映小鼠對(duì)新環(huán)境的探索活動(dòng)，后40 min反映小鼠自發(fā)活動(dòng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行處理和分析，各組結(jié)果比較采用單因素方差分析并進(jìn)一步做兩兩比較(LSD法)，分析品系、性別、節(jié)律對(duì)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果指標(biāo)的影響采用三因素析因?qū)嶒?yàn)方差分析。數(shù)據(jù)均以表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 品系因素對(duì)小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的影響3種品系雌性小鼠前10 min探索活動(dòng)中，白天的測(cè)試結(jié)果未見明顯差異，而夜間則顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：C57BL/ 6、BALB/c、KM探索活動(dòng)依次遞增(P(CFN；BFN)= 0.018，P(CFN；KFN)＜0.001，P(BFN；KFN)=0.001)；雄性小鼠則不論白天夜間，BALB/c、KM都顯著高于C57BL/6小鼠(P(CMD；BMD)=0.001，P(CMD；KMD)= 0.006；P(CMN；BMN)=0.026，P(CMN；KMN)=0.041，圖1A)。

3種品系雌性小鼠后40 min自發(fā)活動(dòng)的測(cè)試結(jié)果：在白天，盡管C57BL/6、BALB/c之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但3者在數(shù)值上呈遞增趨勢(shì)(其中P(CFD；KFD)=0.006)；在夜間，C57BL/6、BALB/c、KM之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，依次遞增(P(CFN；BFN)=0.001，P(CFN；KFN)＜0.001，P(BFN；KFN)=0.001)。3種品系雄性小鼠在白天BALB/c、KM結(jié)果高于C57BL/6，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(CMD；BMD)＜0.001，P(CMD；KMD)= 0.001)，在夜間BALB/c活動(dòng)量依然最高，C57BL/6、KM間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(CMN；BMN)＜0.001，P(BMN；KMN)=0.011，圖1B)。

2.2 性別因素對(duì)3種品系小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的影響3種品系小鼠白天前10 min測(cè)試結(jié)果中，BALB/c活動(dòng)量雄性高于雌性(P(BFD；BMD)=0.006)，C57BL/6和昆明雌雄小鼠則差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；夜間測(cè)試結(jié)果顯示KM雌性小鼠活動(dòng)量顯著高于雄性(P(KFN；KMN)＜0.001)，C57BL/6和BALB/c雌性和雄性活動(dòng)量未見差異(圖2A)。后40 min結(jié)果與前10 min一致(P(BFD；BMD)=0.011，P(KFN；KMN)＜0.001，圖2B)。

圖1 不同品系小鼠在曠場(chǎng)中探索活動(dòng)和自發(fā)活動(dòng)結(jié)果Fig.1 Effects of strain on mice exploratory behavior and spontaneous activities in OFT(n=8)

圖2 不同性別小鼠在曠場(chǎng)中探索活動(dòng)和自發(fā)活動(dòng)結(jié)果Fig.2 Effects of sex on mice exploratory behavior and spontaneous activities in OFT(n=8)

2.3 生物節(jié)律因素對(duì)3個(gè)品系小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的影響3種品系雄性小鼠在前10 min不同測(cè)試時(shí)間測(cè)試結(jié)果差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；雌性小鼠則只有C57BL/6晝夜結(jié)果未見差異，BALB/c和昆明小鼠均表現(xiàn)夜間活動(dòng)多于白天(P(BFD；BFN)=0.013，P(KFD；KFN)＜0.001，圖3A)。后40 min，結(jié)果與前10 min一致(P(BFD；BFN)=0.008，P(KFD；KFN)＜0.001，圖3B)。

圖3 不同節(jié)律條件下小鼠在曠場(chǎng)中探索活動(dòng)和自發(fā)活動(dòng)結(jié)果Fig.3 Effects of circadian rhythm on mice exploratory behavior and spontaneous activities in OFT(n=8)

2.4 品系、性別、節(jié)律對(duì)小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響的三因素析因分析結(jié)果對(duì)探索活動(dòng)的析因方差分析結(jié)果表明品系、節(jié)律對(duì)小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中探索活動(dòng)有影響；品系與性別、性別與節(jié)律的交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(品系*性別)=0.012，P(性別*節(jié)律)=0.016)；品系、性別與節(jié)律的交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(品系*性別*節(jié)律)= 0.013)。通過比較不同組合下的均值可以得出：3種品系中，C57BL/6小鼠探索活動(dòng)均低于BALB/c和昆明小鼠，其中，雄性C57BL/6小鼠在白天探索活動(dòng)最少。

對(duì)自發(fā)活動(dòng)的析因方差分析結(jié)果表明品系、性別、節(jié)律對(duì)小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中自發(fā)活動(dòng)有影響；品系與性別、性別與節(jié)律的交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(品系*性別)＜0.001，P(性別*節(jié)律)＜0.001)；品系、性別與節(jié)律的交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(品系*性別*節(jié)律)= 0.005)。比較不同組合下自發(fā)活動(dòng)均值可得出：C57BL/6自發(fā)活動(dòng)顯著少于BALB/c和昆明小鼠，其中雄性C57BL/6小鼠在白天自發(fā)活動(dòng)最少(表1)。

表1 各組小鼠曠場(chǎng)探索活動(dòng)和自發(fā)活動(dòng)路程結(jié)果Tab.1 Results of exploratory behavior and spontaneous activities of each group in OFT()

表1 各組小鼠曠場(chǎng)探索活動(dòng)和自發(fā)活動(dòng)路程結(jié)果Tab.1 Results of exploratory behavior and spontaneous activities of each group in OFT()

前10 min路程反映小鼠對(duì)新環(huán)境的探索活動(dòng)，后40 min路程反映小鼠自發(fā)活動(dòng)。

品系性別節(jié)律前10 min路程(cm)后40 min路程(cm) C57BL/6雌性(F)白天(D)3 913.09±635.81 9 704.39±1 047.01夜間(N)3 857.01±384.75 9 875.58±932.02雄性(M)白天(D)3 510.14±1 194.35 8 515.29±1 076.94夜間(N)4 009.83±703.69 9 474.95±1 659.52 BALB/c雌性(F)白天(D)3 804.20±708.66 12 446.81±2 826.60夜間(N)4 906.87±567.83 17 339.89±3 575.37雄性(M)白天(D)4 984.51±1 179.64 17 001.08±4 590.25夜間(N)4 968.26±808.78 16 196.60±2 995.43 KM 4 715.58±702.49 11 647.49±2 559.60雌性(F)白天(D)4 490.78±890.69 14 833.01±6 256.62夜間(N)6 434.80±1 192.56 23 378.96±6 191.70雄性(M)白天(D)4 802.79±478.69 14 352.77±1 378.84夜間(N)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過不同性別的C57BL/6、BALB/c、昆明小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)(晝夜生物節(jié)律期不同)條件下進(jìn)行1h曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)試，分析其探索行為與自發(fā)活動(dòng)。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是一種通過檢測(cè)動(dòng)物自主活動(dòng)(locomotor activity)研究動(dòng)物行為的實(shí)驗(yàn)方法［13］。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)原理是基于嚙齒類動(dòng)物的趨觸性(thigmotaxis)，指的是小鼠畏懼開闊、未知、可能存在潛在危險(xiǎn)的場(chǎng)所，因而表現(xiàn)出“貼墻”活動(dòng)［14］的特性。一般認(rèn)為，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中小鼠的水平活動(dòng)(ambulation)反映動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)活性，垂直運(yùn)動(dòng)(rearing)反映動(dòng)物對(duì)新鮮環(huán)境的好奇程度［13］，糞便顆數(shù)反映動(dòng)物在新環(huán)境中的緊張狀態(tài)［5，15］。在未適應(yīng)敞箱情況下，前10～20 min反映小鼠的探索活動(dòng)，20～60 min反映小鼠自發(fā)活動(dòng)［9］，60 min后小鼠活動(dòng)減少，活動(dòng)趨于穩(wěn)定，小鼠表現(xiàn)出較明顯的晝夜活動(dòng)特點(diǎn)［16］。在人類漫長(zhǎng)的培育過程中，實(shí)驗(yàn)小鼠已分化為多個(gè)品系如Swiss、ICR、BALB/c、C57BL/6等。其中，C57BL/6和BALB/c小鼠是科學(xué)研究中常用但遺傳背景差異較大的兩個(gè)近交系，而昆明小鼠一直是我國特有的并且使用量最大的封閉群小鼠［17-18］。以往研究表明，近交系小鼠與封閉群小鼠在基礎(chǔ)活動(dòng)、學(xué)習(xí)能力以及對(duì)危險(xiǎn)的反應(yīng)等方面相對(duì)存在較大差異［19］。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C57BL/6小鼠無論是對(duì)新環(huán)境的探索行為還是自發(fā)活動(dòng)量均顯著低于昆明小鼠，而與BALB/c相比，除雌性小鼠在白天探索活動(dòng)、自發(fā)活動(dòng)無差異外，其他情況下均顯著更低，似乎在面對(duì)新環(huán)境時(shí)存在更明顯焦慮樣行為，此結(jié)果也在相關(guān)研究得到印證［17］。而因處于焦慮狀態(tài)的動(dòng)物前10～20 min的活動(dòng)記錄低，給予動(dòng)物抗焦慮藥物后這段時(shí)間的運(yùn)動(dòng)會(huì)相應(yīng)增高［9］，由此結(jié)合本研究結(jié)果，我們認(rèn)為，為獲取更準(zhǔn)確、更穩(wěn)定的結(jié)果，在為焦慮相關(guān)疾病及其相關(guān)神經(jīng)行為實(shí)驗(yàn)選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物時(shí)，應(yīng)優(yōu)先考慮C57BL/6小鼠。

性別因素對(duì)小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的影響主要體現(xiàn)在自發(fā)活動(dòng)上，探索活動(dòng)受性別的影響則不明顯。這可能是因?yàn)榇菩郾旧砩聿顒e而使得小鼠自發(fā)活動(dòng)量受性別因素影響較大，對(duì)新環(huán)境的探索及其焦慮狀態(tài)則與性別差異不大。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，C57BL/6雌雄小鼠在白天與夜間所測(cè)探索與自發(fā)活動(dòng)均未見明顯差異，BALB/c雄鼠在白天曠場(chǎng)活動(dòng)顯著高于雌鼠，夜間則未見明顯差異，而昆明小鼠則是雌鼠在夜間自發(fā)活動(dòng)高于雄鼠，白天未見差異。據(jù)此，我們認(rèn)為C57BL/6小鼠可能比較適用于需去除或淡化性別因素的實(shí)驗(yàn)中。

在同等條件下，C57BL/6小鼠曠場(chǎng)結(jié)果不因晝夜節(jié)律而產(chǎn)生差異，而昆明和BALB/c卻只有雄性小鼠在白天和黑夜的探索行為及自發(fā)活動(dòng)量上未見明顯差異，雌性小鼠在探索行為和自發(fā)活動(dòng)量上則均表現(xiàn)為夜間比白天高。昆明和BALB/c雌性小鼠在晝夜節(jié)律上表現(xiàn)出差異，可能是由于雌鼠相比雄鼠而言更易受性激素影響從而對(duì)晝夜節(jié)律作用的本實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾，而雌性C57BL/6受此影響則較小。根據(jù)研究報(bào)道，C57BL/6雄性小鼠在上午與下午的曠場(chǎng)測(cè)試中差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［20］，可見C57BL/6雄性小鼠在一天多個(gè)時(shí)間段的活動(dòng)均較穩(wěn)定。故本研究結(jié)果提示，在實(shí)驗(yàn)不好控制晝夜節(jié)律因素時(shí)，為獲取較可靠結(jié)果，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可選擇C57BL/6小鼠。

綜上所述，在本實(shí)驗(yàn)中近交系C57BL/6小鼠對(duì)新環(huán)境的探索活動(dòng)少，自發(fā)活動(dòng)量低，在不同性別、晝夜節(jié)律條件下表現(xiàn)比較穩(wěn)定，可見C57BL/6小鼠是可用于神經(jīng)行為學(xué)研究的“黃金品系”［21］。

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(編輯 國 榮)

Effects of strain，sex and circadian rhythm on open field test on mice

LIU You-ping1，LIU Tian2，BI Hang2，ZHANG Lei1，DANG Yong-hui3
(1.Zong Lian College，2.Qi De College，3.College of Medicine&Forensics of Health Science Center，Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China)

ObjectiveTo investigate the effects of sex，strain and circadian rhythm on open field test(OFT).MethodsBy using OFT，we analyzed exploratory behavior and spontaneous activities of male and female Kunming BALB/c and C57BL/6 mice in new surroundings in the day time or at night.Results①The exploratory behavior and spontaneous activities of C57BL/6 mice were significantly fewer than those of Kunming and BALB/c mice.②The exploratory behavior and spontaneous activities of male and female Kunming and BALB/c mice in the day time presented significant differences compared with those at night.③The exploratory behavior and spontaneous activities of female Kunming and BALB/c mice were significantly more at night than in the day time.ConclusionC57BL/6 mice had fewer exploratory behavior and lower spontaneous activities in novel surroundings.And sex or circadian rhythm had relatively small effects on OFT in C57BL/6 mice.C57BL/6 mice are suitable for research on neuroethology and anxiety disorders.

open field test；exploratory behavior；spontaneous activity；strain；sex；circadian rhythm；neuroethology；BALB/c mice；C57BL/6 mice；Kunming mice

R338

A

1671-8259(2014)05-0634-05

10.7652/jdyxb201405013

2013-10-10

2014-01-01

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81171262，81371473)；國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練基金項(xiàng)目(No.201310698072) Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81171262，81371473)and the National Innovation Training Program for University Students(No.201310698072)

黨永輝，副教授.E-mail：psydyh@mail.xjtu.edu.cn

劉友平(1993-)，男(漢族)，本科在讀.E-mail：jiangxiyouyou@stu.xjtu.edu.cn

時(shí)間：2014-07-22 16∶19 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140722.1619.005.html