周曉靚，王浩，李衛(wèi)紅，施培基，周則衛(wèi)

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所藥物室，天津 300192)

·制藥技術(shù)·

7β-苯乙酰胺-3-頭孢美法侖-4-頭孢烷酸的合成*

周曉靚，王浩，李衛(wèi)紅，施培基，周則衛(wèi)

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所藥物室，天津 300192)

美法侖與二苯基重氮甲烷經(jīng)回流反應(yīng)制得美法侖二苯甲酯(3);首次采用7-苯乙酰氨基-3-氯甲基-4-頭孢烷酸對(duì)甲氧基芐酯與3在DBU作用下經(jīng)“一鍋法”反應(yīng)后水解合成了前體藥物頭孢美法侖(7β-苯乙酰胺-3-頭孢美法侖-4-頭孢烷酸)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和ESI-MS確證。

前藥;頭孢菌素;美法侖;藥物;合成

化療是當(dāng)前治療惡性腫瘤的重要手段之一。如何增加化療藥物在腫瘤的局部濃度同時(shí)降低全身暴露濃度是當(dāng)前腫瘤靶向治療的熱點(diǎn)。抗體導(dǎo)向酶解前藥治療(ADEPT)可在增加靶細(xì)胞藥物濃度的同時(shí)降低正常組織的藥物濃度，減少化療引起的毒副作用并提高療效。在ADEPT研究系統(tǒng)中，根據(jù)β-內(nèi)酰胺酶的生化特點(diǎn)和頭孢菌素的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選擇β-內(nèi)酰胺酶為活化酶，頭孢菌素拼合細(xì)胞毒化合物作為底物，在ADEPT研究中較為常見［1-2］。頭孢美法侖(6)是將頭孢菌素與氮芥類非特異性抗腫瘤藥物拼合而成的前體藥物，在β-內(nèi)酰胺酶的特異性作用下可以轉(zhuǎn)化為原型藥物美法侖，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

文獻(xiàn)［3］方法中，6的合成以7-ACA為原料制得重要活性中間體7-羥甲基頭孢后，再與美法侖(1)進(jìn)行偶聯(lián)而得。該方法合成步驟多，涉及多個(gè)活性基團(tuán)的保護(hù)和去保護(hù)。

本文以1與二苯基重氮甲烷(2)經(jīng)回流反應(yīng)制得美法侖二苯甲酯(3)后;首次采用7-苯乙酰氨基-3-氯甲基-4-頭孢烷酸對(duì)甲氧基芐酯(GCLE，4)為原料，與3在1，8-二氮雜二環(huán)［5.4.0］十一碳-7-烯(DBU)作用下經(jīng)“一鍋法”反應(yīng)后水解合成了用于腫瘤靶向治療的前藥6(Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和ESI-MS確證。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Varian Mercury Vx-300型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo));WATERS ALLIANCE型高效液相色譜儀［ODS柱(4.5 mm×250 mm)，流動(dòng)相:甲醇/乙酸胺緩沖液/乙酸=80/20/1，流速: 1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm］。

2 按文獻(xiàn)［4］方法合成;1，蘇州立德化學(xué)有限公司;4，天津津康藥業(yè)有限公司;DBU，北京偶合科技有限公司;其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1)3的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入丙酮30 mL和1 1.2 g (3.9 mmol)，攪拌使其呈混懸液;緩慢加入新制的2(12 mmol)的正己烷(12 mL)溶液，加畢，回流反應(yīng)2 h［TLC監(jiān)測(cè)，展開劑:A=V(乙酸乙酯)∶V(環(huán)己烷)=4∶1］。過(guò)濾，濾液減壓濃縮后經(jīng)加壓硅膠柱層析(梯度洗脫劑:A=1∶1～1∶0)純化得黃色油狀物3 1.4 g，收率76%，Rf=0.2(展開劑:A=1∶1);1H NMR δ:7.36～7.22(m，10H)，6.94～6.90(m，2H)，6.49～6.47(d，J=8.4 Hz，2H)，3.84～3.79(m，1H)，3.70～3.55(m，8H)， 3.06～3.00(dd，J=5.7 Hz，5.4 Hz，1H)，2.90～2.83(dd，J=6.9 Hz，7.2 Hz，1H)，1.94(br，2H)。

(2)7β-苯乙酰胺-3-頭孢美法侖-4-頭孢烷酸對(duì)甲氧基芐酯(5)的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入DMF 15 mL和4 1.0 g (2 mmol)，攪拌使其呈混懸液;加入3 1.3 g(2 mmol)，于-5℃加入碘化鉀0.8 g(4.8 mmol)，緩慢滴加DBU 600 μL，滴畢，避光反應(yīng)5 h(TCL監(jiān)控，反應(yīng)液顏色逐漸加深)。用乙酸乙酯(3×30 mL)萃取，合并萃取液，依次用10%硫代硫酸鈉溶液、10%檸檬酸水溶液和飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鎂干燥，減壓濃縮后經(jīng)加壓硅膠柱層析(梯度洗脫劑:A=1∶1～1∶0)純化得淡黃色固體5 750 mg，收率40%，Rf=0.35(展開劑:A=1∶1);1H NMR δ:7.37～7.26(m，18H)，7.01～6.98 (d，J=5.7 Hz，2H)，6.80(s，2H)，6.52～6.49 (d，J=9.0 Hz，2H)，6.05～6.02(d，J=9.0 Hz，1H)，5.85～5.80(m，1H)，5.35～5.34 (dd，J=4.2 Hz，5.7 Hz，1H)，4.89～4.88(d，J=5.1 Hz，1H)，4.12～3.55(m，16H)，3.21～3.15(dd，J=8.4 Hz，9.6 Hz，2H)，1.70(s，2H);ESI-MS m/z:920.291 1［M+］。

(3)6的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入二氯甲烷5 mL和5 400 mg(0.43 mmol)，攪拌使其溶解;加入苯甲醚1 mL，冰浴冷卻下緩慢滴加三氟乙酸(TFA)1 mL(5 min)，滴畢，于室溫反應(yīng)30 min。傾入50 mL冷的異丙醚(析出淡黃色固體)，離心(2 500 rpm，10 min)分離得5的三氟乙酸鹽，經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:乙醇)純化得類白色固體6 120 mg，含量93.53%(T=3.341 min)，Rf=0.75［展開劑:V(乙醇)∶V(乙酸)=10∶1］;UV:259.7 nm，301.3 nm;1H NMR δ:8.51(s，1H)，8.21(d，J=8.3 Hz，1H)，7.31～7.30(m，5H)，6.97(s，2H)，6.59～6.56(d，J=8.7 Hz，2H)，5.61～5.59(dd，J=4.8 Hz，1H)，5.12～5.07(d，J=13.8 Hz，1H)，4.82～4.80(d，J=4.8 Hz，1H)，4.58～4.54(d，J=13.3 Hz，1H)，4.05～4.01(m，1H)，3.76～3.21(m，12H)，3.00(dd，1H)，2.70(dd，1H);ESI-MS m/z:631.27{［M-3H］3-}。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

文獻(xiàn)報(bào)道6的合成以7-ACA為原料，需要合成主要中間體3-羥甲基頭孢烷酸，然后與1，2，2，2-四氯乙基氯甲酸(Ⅰ)反應(yīng)制得活性中間體3-四氯甲基氯甲酸酯，最后與1的氨基反應(yīng)合成偶聯(lián)化合物。該路線步驟長(zhǎng)，Ⅰ為進(jìn)口試劑，獲得困難。本文以4為原料，利用DBU“一鍋法”反應(yīng)制得偶聯(lián)化合物，大大縮短了實(shí)驗(yàn)路線。

在頭孢美法侖的偶聯(lián)反應(yīng)(3→5)中，對(duì)1的羧酸成酯進(jìn)行保護(hù)，如果使用未保護(hù)的1進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，所得優(yōu)勢(shì)產(chǎn)物為頭孢菌素3-位氯甲基與1的羧酸反應(yīng)成酯產(chǎn)物(Ⅱ)，在TFA水解過(guò)程中酯鍵會(huì)斷裂生成3-甲基頭孢菌素(Ⅲ)和1 (Scheme 2)。

頭孢菌素衍生物合成難度主要表現(xiàn)為對(duì)酸堿不穩(wěn)定，反應(yīng)產(chǎn)物難于重結(jié)晶，純化困難等。本路線中的4在堿性條件下易發(fā)生2-位和3-位的雙鍵易位［5］，因此偶聯(lián)反應(yīng)中的縛酸劑的選擇很關(guān)鍵。常用的K2CO3和三乙胺等堿均可能帶來(lái)雙鍵易位的副產(chǎn)物，難以通過(guò)柱層析分離。而DBU則能夠避免雙鍵易位，制得較為單一的產(chǎn)物。

本文首次通過(guò)一鍋法以4為原料合成了頭孢美法侖前藥6，以DBU為縮合劑避免了副產(chǎn)物生成，簡(jiǎn)化了合成路線。

該路線也可能用于其他頭孢菌素衍生物的合成改造，為腫瘤靶向治療ADEPT的研究提供了化學(xué)基礎(chǔ)。

［1］David E Kerr，Zhengong Li，Nathan O Siemers，et al．Development and activities of a new melphalan prodrug designed for tumor-selective activation［J］.Bioconj Chem，1998，2:255-259.

［2］Ralph F Alderson，Brian E Toki，Roberge M，et al．Characterization of a CC49-based single-chain fragment-β-lactamase fusion protein for antibody-directed enzyme prodrug therapy(ADEPT)［J］.Bioconj Chem，2006，17:410-418.

［3］Brian E Toki，Peter D Senter.Melphalan Prodrug ［P］.US 20 050 214 310，2005.

［4］呂茜茜，周曉靚，王榮先.二苯基重氮甲烷的合成［J］.化學(xué)試劑，2008，30(2):147-147.

［5］Ryan M Phelan，Marc Ostermeier，Craig A Townsend. Design and synthesis of a β-lactamase activated 5-fuorouracil prodrug［J］.Bioorg Med Chem Lett，2009，19:1261-1263.

Synthesis of 7β-Phenethyl Carboxamido-3-melphalan-4-cephalosporin

ZHOU Xiao-liang，WANG Hao，LI Wei-hong，SHI Pei-ji，ZHOU Ze-wei

(Pharmceutical department，Institute of Radiation Medicine，Chinese Academy of Medical Sciences，Tianjin 300192，China)

Melphalan diphenylmethyl ester(3)was synthesized by reflux of Melphalan with diphenyldiazomethane.A cephalosporin-mustard prodrug，Cephalosporin melphalan(7β-Phenethyl Carboxamido-3-melphalan-4-cephalosporin)，was synthesized by“one-pot”reaction of 7-phenylacetamide-3-chloromethylcephalosporanic acid p-methoxybenzyl ester with 3 and then hydrolysis for the first time. The structure was confirmed by1H NMR and ESI-MS.

prodrug;cephalosporin;Melphalan;synthesis

O621.3;R914.5

A

1005-1511(2014)03-0416-03

2013-12-25;

2014-04-17

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81301983);研究所發(fā)展基金資助項(xiàng)目(SF1305)

周曉靚(1979-)，女，回族，寧夏石嘴山人，博士研究生，助理研究員，主要從事頭孢菌素類靶向前藥及輻射防護(hù)藥的合成研究。Tel.022-85683041，E-mail:zhouxiaoliang@irm-cams.ac.cn

王浩，E-mail:wanghao@irm-cams.ac.cn