任艷鑫，李曉江，張麗娟，楊 潔，孫瑞梅，張世文，張 吉

(昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院：1. 頭頸腫瘤研究中心；2. 病理科，云南昆明 650118)

鼻咽癌是中國南方及東南亞地區(qū)常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病與EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)感染密切相關[1-2]。然而，僅僅感染EBV還不足以導致細胞癌變，機體的某些因素也起著重要的作用，細胞介導的免疫反應是機體清除惡性細胞的主要機制。TAP主要功能是與低分子多肽復合物-2、7(1ow molecular mass polypeptide, LMP-2、7)一起加工、轉運內源性抗原肽(其中包括腫瘤抗原)至內質網，在內質網錨定的MHC(主要是HLA-I)結合抗原肽后將其呈遞至細胞表面供CD8+細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes, CTLs)識別，從而啟動細胞免疫。細胞免疫在機體抗腫瘤免疫中具有重要作用。HLA-I類分子腫瘤抗原可組成T細胞激活的第一信號，激活HLA特異性CD8+CTL，發(fā)揮抗腫瘤免疫效應。研究發(fā)現(xiàn)，在小細胞肺癌、結直腸癌、乳腺癌、惡性黑色素瘤、頭頸惡性腫瘤及腦惡性腫瘤中都發(fā)現(xiàn)TAP-1、LMP-2/7及HLA-1的缺失或下調，轉染TAP-1后可誘導LMP-2/7及HLA-I表達的增加[3-6]。本文著重研究鼻咽部組織中TAP-1、TAP-2及HLA-I的表達及其對鼻咽癌患者免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1實驗標本選取2000年1月至2002年12月我院病理科存檔的蠟塊標本共78例(均為活檢和手術切除的標本)，其中包括鼻咽部非特異性炎癥組織20例(入選對照組者均為患者自感不適，經本人及家屬同意在我院行鼻咽部取材，病理檢查排除)，鼻咽癌標本58例(患者臨床資料見表1)。所有標本經免疫組化證實且為治療前收集，血液標本每人取外周血2 mL，肝素抗凝，所有標本采集之前均經患者同意。所有鼻咽癌患者在病理確診后根據(jù)NCCN指南(頭頸部腫瘤臨床實踐指南)進行治療。Ⅰ期患者接受根治性放療，Ⅱ期+Ⅲ期及無遠處轉移的Ⅳ期患者接受TPU化療4～6周期以及根治性放療，有遠處轉移的Ⅳ期患者接受TPU化療6周期以及姑息性放療，患者均接受定期隨訪。

表1鼻咽癌患者的臨床特征

Tab.1 Clinical characteristics of the NPC patients

參 數(shù)例數(shù)(%) 性別 男38(65.5) 女20(34.5)年齡(歲)49.23(14～84)臨床分期 Ⅰ4(6.9) Ⅱ18(31.0) Ⅲ10(17.3) Ⅳ26(44.8)病理類型 高或中分化5(8.6) 未分化53(91.4)淋巴結轉移 N017(29.3) N1～341(70.7)遠處器官轉移 M048(82.8) M110(17.2)

1.2實驗試劑兔抗人HLA-I多克隆抗體購自美國Epitomics公司，兔抗人TAP-1多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，兔抗人TAP-2單克隆抗體購自香港Abcam公司，IL-10酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自美國Biosource公司，SP免疫組化通用試劑盒購自北京中山公司，PE標記的鼠抗人CD8，F(xiàn)ITC標記的鼠抗人CD4抗體，PC5標記的鼠抗人CD45抗體，同型對照分別為PE標記的鼠抗人IgG免疫球蛋白，F(xiàn)ITC標記的鼠抗人IgG免疫球蛋白試劑均為Beckman Coulter公司提供。

1.3免疫組織化學方法將中性甲醛固定、石蠟包埋的鼻咽部組織標本制成4 μm厚的切片，采用SP免疫組化染色。用購自北京中杉公司的陽性對照片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。主要步驟：①石蠟切片脫蠟到水。②微波抗原修復。③30 mL/L H2O2-甲醇溶液浸泡10 min。④加100 mL/L山羊血清置室溫20 min。⑤加一抗工作液4 ℃孵育過夜。⑥加生物素化二抗工作液，37 ℃孵育10 min。⑦加HRP標記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育10 min。⑧DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封固。

1.4結果判定TAP-1、TAP-2陽性染色為棕黃色，陽性信號主要位于細胞胞質。HLA-I類抗原陽性染色為棕黃色，陽性信號主要位于細胞胞質及細胞膜。綜合染色反應強度和陽性細胞數(shù)量兩個方面進行半定量記分法判定：按陽性著色程度評分，0分為無色；1分為淺黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。按陽性細胞比例評分，0分<5%；1分為5%～10%；2分為11%～50%；3分為51%～80%；4分為>80%。兩者乘積判定陽性結果：0分為陰性(-)；1～4分為弱陽性(+)；5～8分為中度陽性()；9～12分為強陽性()。

1.5流式細胞術檢測外周血T細胞比例取全血100 μL，加三色熒光抗體10 μL，陰性對照相同，避光室溫靜置20 min，用Q-prep自動溶血，30 min后上機檢測，分析外周血及組織中CD4+T、CD8+T細胞，CD45+細胞為淋巴細胞，分別計算CD4+T、CD8+T細胞在淋巴細胞中的比值。

1.6ELISA法檢測外周血中IL-10水平外周血收集后于離心機3 000 r/min離心25 min，收集上清液，再用包被緩沖液稀釋為1∶400備用。按照試劑盒操作步驟進行。

1.7統(tǒng)計學分析采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，生存率用Kaplan-Meier法計算，顯著性檢驗采用Log-rank法檢驗，預后進行單因素分析、多因素Logistic回歸模型分析，當P<0.05時認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1鼻咽癌組織中TAP-1、TAP-2及HLA-I低表達TAP-1、TAP-2主要在細胞胞質中分布，在鼻咽正常組織中呈中度陽性或強陽性表達，陽性率分別為90%、95%(18/20、19/20)，表現(xiàn)為棕黃色或棕褐色。在鼻咽癌組織中大部分呈陰性或弱陽性43.1%、46.55%(25/58、27/58)(圖1)。HLA-I主要在細胞胞質及胞膜上分布，在鼻咽正常組織中呈中度陽性或強陽性表達，陽性率為95%(19/20)，表現(xiàn)為棕黃色或棕褐色。在鼻咽癌組織中大部分呈陰性或弱陽性，陽性率為50%(29/58)(圖1、表2)。

圖1TAP-1，TAP-2及HLA-I在鼻咽癌及鼻咽正常組織中的表達

Fig.1 Expressions of TAP-1, TAP-2 and HLA-I in NPC and normal nasopharyngeal tissue

A、C、E：分別為TAP-1、TAP-2、HLA-I在鼻咽癌組織中低表達或無表達(×400)；B、D、F：分別為TAP-1、TAP-2、HLA-I在鼻咽正常組織中高表達(×400)。

表2鼻咽部不同病變組織中TAP-1、TAP-2及HLA-I的表達

Tab.2 Expressions of TAP-1 and 2 and HLA-I in NPC and control groups

組 別例數(shù)TAP-1表達*陰性陽性TAP-2表達*陰性陽性HLA-I表達*陰性陽性慢性炎癥組20218119119鼻咽癌組58332531272929

兩組比較，*P<0.01。

2.2鼻咽癌外周血中CD4+T、CD8+T細胞及IL-10的變化我們采用流式細胞術檢測鼻咽癌組及對照組外周血中CD4+、CD8+T細胞及IL-10。鼻咽癌組CD4+T細胞有不同程度降低，明顯低于對照組[(33.41±10.04)%vs. (40.15±3.56)%](P<0.05)，而CD8+T細胞略有升高，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義[(25.32±8.29)%vs.(22.89±2.24)%](P>0.05)。鼻咽癌IL-10表達明顯高于對照組[(13.12±1.23)ng/mLvs.(3.69±1.03)ng/mL](P<0.05，圖2)。

圖2鼻咽癌組及對照組外周血中CD4+、CD8+T細胞的比例

Fig.2 The percentages of CD4+T cells and CD8+T cells in peripheral blood lymphocytes in NPC and control groups

A：CD4+T細胞在鼻咽癌患者外周血中比例為33.0%；B：CD4+T細胞在對照組外周血中比例為42.4 %；C：CD8+T細胞在鼻咽癌患者外周血中比例為25.2%；D：CD8+T細胞在對照組外周血中比例為22.4%。

2.3鼻咽癌中TAP-1、TAP-2及HLA-I與臨床因素的關系在58例鼻咽癌中，我們發(fā)現(xiàn)TAP-1、TAP-2及HLA-I表達與年齡、性別無相關性(P>0.05)，而與TNM分期、有無淋巴結轉移及有無遠處轉移密切相關(P<0.05，表3)。

表3鼻咽癌組織中TAP-1、TAP-2和HLA-I與臨床參數(shù)的關系

Tab.3 Association of TAP-1, TAP-2 and HLA-I expressions with clinical factors in NPC

參 數(shù)TAP-1陽性陰性PTAP-2陽性陰性PHLA-I陽性陰性P年齡(歲) ≤4312(48%)16(48.5%)1.00015(55.5%)13(41.9%)0.43010(34.5%)18(62.1%)0.065 >4313(52%)17(51.5%)12(44.4%)18(58.1%)19(65.5%)11(37.9%)性別 男17(68%)21(63.6%)0.78616(59.3%)22(71%)0.41320(69%)18(62.1%)0.783 女8(32%)12(36.4%)11(40.7%)9(29%)9(31%)11(37.9%)TNM分期 Ⅰ+Ⅱ13(52%)7(21.2%)0.01515(55.6%)5(16.1%)0.00215(51.7%)5(17.2%)0.012 Ⅲ+Ⅳ12(48%)26(78.8%)12(44.4%)26(83.9%)14(48.3%)24(82.8%)頸淋巴結轉移 有11(44%)30(90.9%)0.00012(44.4%)29(93.5%)0.00013(44.8%)28(96.6%)0.000 無14(56%)3(9.1%)15(55.6%)2(6.5%)16(55.2%)1(3.4%)遠處轉移 有1(4%)9(27.3%)0.0331(3.7%)9(29%)0.0140(0%)10(35.7%)0.000 無24(96%)24(72.7%)26(96.3%)22(71%)29(100%)19(64.3%)

2.4鼻咽癌中TAP-1、TAP-2及HLA-I表達與CD4+T、CD8+T細胞及IL-10的關系為了明確TAP-1、TAP-2及HLA-I表達是否對CD4+T細胞、CD8+T細胞及IL-10表達具有影響，我們分別將58例鼻咽癌患者分為TAP-1陽性組和陰性組，TAP-2陽性組和陰性組，HLA-I陽性組和陰性組，分析3種不同組別中CD4+T細胞、CD8+T細胞及IL-10表達的不同。CD4+T細胞在TAP-1、TAP-2、HLA-I陽性組與陰性組中表達差異無統(tǒng)計學意義(33.19±9.2vs. 33.35±8.05；33.58±6.4vs. 32.52±5.2； 34.34±6.58vs. 30.22±3.49；P>0.05)。CD8+T細胞在TAP-1、TAP-2、HLA-I陽性組均高于陰性組，差異具有統(tǒng)計學意義(27.93±4.04vs. 18.43±2.37；28.47±3.62vs. 19.18±2.11；31.35±4.72vs. 16.65±2.07；P<0.05)。IL-10在TAP-1、TAP-2、HLA-I陽性組均低于陰性組，差異具有統(tǒng)計學意義(9.87±1.24vs. 16.20±1.48；8.93±0.56vs. 16.04±1.75；6.28±0.86vs. 17.99±2.01；P<0.05，表4)。

表4鼻咽癌患者TAP-1、TAP-2、HLA-I表達與CD4+T、CD8+T細胞、IL-10的表達的關系

Tab.4 Analysis of CD4+T cells, CD8+T cells and IL-10 expression in different TAP-1, TAP-2, HLA-I expression groups in NPC

項目TAP-1陽性陰性PTAP-2陽性陰性PHLA-I陽性陰性PCD4+細胞(%)33.19±9.233.35±8.050.97033.58±6.432.52±5.20.81534.34±6.5830.22±3.490.379CD8+細胞(%)27.93±4.0418.43±2.370.01328.47±3.6219.18±2.110.01831.35±4.7216.65±2.070.005IL-10(ng/mL)9.87±1.2416.20±1.480.0218.93±0.5616.04±1.750.0156.28±0.8617.99±2.010.008

2.5影響鼻咽癌患者預后的單因素分析58例患者均按照NCCN指南進行規(guī)范化治療并定期隨訪，將可能影響鼻咽癌治療后進展的因素進行單因素Kaplan-Meier分析，列入的相關因素包括：年齡、性別、臨床分期、有無淋巴結轉移、有無遠處器官轉移、病理分型、TAP-1表達、TAP-2表達和HLA-I表達。我們發(fā)現(xiàn)臨床分期、有無淋巴結轉移、有無遠處器官轉移、病理分型、TAP-1表達、TAP-2表達及HLA-I表達與鼻咽癌患者預后相關，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3)。

圖3 鼻咽癌單因素Kaplan-Meier分析圖Fig.3 Kaplan-Meier curve for survival by different clinicopathologic factorsA:Ⅰ+Ⅱ期鼻咽癌患者生存率顯著高于Ⅲ+Ⅳ期患者(56.25% vs. 38.89%, P<0.01);B:無淋巴結轉移的鼻咽癌患者生存率明顯高于有淋巴結轉移患者(47.06% vs. 43.90%, P<0.05);C:無遠處器官轉移的鼻咽癌患者生存率明顯高于有遠處器官轉移患者(54.35% vs 8.33%, P<0.01);D:低分化或未分化鱗癌的鼻咽癌患者生存率明顯高于中、高分化鱗癌患者(49.06% vs. 0%, P<0.05);E: TAP-1表達陽性鼻咽癌患者生存率明顯高于表達陰性患者(60.0% vs. 33.33%, P<0.01);F:TAP-2表達陽性鼻咽癌患者生存率明顯高于表達陰性患者(62.96% vs.29.03%, P<0.01);G:HLA-I表達陽性鼻咽癌患者生存率明顯高于表達陰性患者(65.52% vs. 24.14%, P<0.01)。

2.6鼻咽癌患者預后的多因素Logistic回歸模型分析我們進一步將鼻咽癌患者多種因素(包括年齡、性別、臨床分期、有無淋巴結轉移、有無遠處器官轉移、病理分型、TAP-1表達、TAP-2表達、HLA-I表達)納入Logistic回歸模型分析。結果顯示，只有有無遠處器官轉移及HLA-I表達為鼻咽癌患者獨立預后因素(P=0.043，P=0.045，表5)。

表5鼻咽癌患者多因素Cox回歸模型分析

Tab.5 Multivariate Cox regression analysis of NPC

因素BSEWaldPExp(B)95.0%CI for Exp(B)年齡-0.2550.3300.5950.4400.7750.406～1.481性別-0.0370.3050.0140.9040.9640.530～1.753TNM分期0.0490.7490.0040.9481.0500.242～4.555淋巴結轉移-0.1440.4310.1120.7370.8660.372～2.013遠處器官轉移-0.8790.4634.5980.043*0.4150.167～1.030病理0.0810.6420.0160.8991.0850.308～3.814TAP-10.0680.9450.0050.9420.9340.147～5.949TAP-20.6551.0210.4120.5210.5190.070～3.844HLA-I0.5800.7774.5570.045*0.5600.122～2.568

3 討 論

抗原處理相關轉運體是MHC-I類分子抗原遞呈途徑中的重要分子。其主要功能是與低分子多肽復合物-2、7(1ow molecular mass polypeptide, LMP-2、7)一起加工、轉運內源性抗原肽(其中包括腫瘤抗原)至內質網，在內質網錨定的MHC(主要是HLA-1)結合抗原肽后將其呈遞至細胞表面供CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)識別，從而啟動細胞免疫。由于MHC-I類基因、TAP基因、LMP-2及LMP-7基因位置靠近，轉錄活性同時受干擾素的誘導，能夠協(xié)調三者基因產物的量，有效提呈抗原，故三者構成的系統(tǒng)被比喻成真核生物MHC-I類分子抗原加工和提呈的“操縱子”。 在腫瘤免疫應答過程中，MHC-I類分子限制的CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)在阻止腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起關鍵作用。MHC-I類分子抗原加工和提呈的“操縱子”的任何組分的改變對腫瘤免疫應答第一信號的產生有直接影響。這些分子的減少或丟失可能反映了腫瘤細胞在MHC-I類分子向T細胞遞呈免疫源性多肽這一作用而選擇的一種逃避機制。

TAP-1啟動子是593 bp的雙向啟動子，包含IFN-r反應元件、p53反應元件和NF-κB結合位點。其中任何異常調節(jié)反應元件及影響NF-κB的因素都可以引起TAP基因的表達異常，從而影響抗原加工和提呈的“操縱子”，最終引起腫瘤細胞表面抗原的表達異常。如果腫瘤細胞表面的TAP蛋白表達下降，將會導致腫瘤細胞的MHC-I類分子的表達下降或缺如[7-10]，結果是腫瘤不呈現(xiàn)或僅呈現(xiàn)弱的抗原性，導致腫瘤抗原無法被遞呈給CD8+的T細胞，從而逃脫免疫監(jiān)管，這是腫瘤免疫逃逸的一個重要機制。

本文鼻咽癌組織中TAP-1、TAP-2及HLA-I陽性表達分別43.1%、46.55%、50%，均顯著低于鼻咽正常組織中的表達。這提示鼻咽癌患者對腫瘤抗原提呈功能減弱，腫瘤細胞很可能發(fā)生免疫逃逸。我們進一步檢測鼻咽癌患者的CD4+T、CD8+T細胞及IL-10的表達變化。具有免疫抑制作用的IL-10表達增加，CD4+T細胞明顯減少，而CD8+T細胞無明顯差異。但是， TAP-1、TAP-2、HLA-I表達陽性鼻咽癌中CD8+T細胞表達升高，而IL-10表達減少。這提示TAP-1、TAP-2、HLA-I表達與腫瘤免疫密切相關，鼻咽癌TAP-1、TAP-2、HLA-I的下調，將抑制具有細胞毒性T淋巴細胞(CD8+T細胞)的數(shù)量，同時具有免疫抑制作用的IL-10分泌增加也將加劇細胞免疫功能的下降，這將為鼻咽癌細胞逃脫機體免疫監(jiān)視創(chuàng)造條件。

我們發(fā)現(xiàn)臨床分期、有無淋巴結轉移、有無遠處器官轉移、病理分型、TAP-1表達、TAP-2表達、HLA-I表達與鼻咽癌患者預后相關。將這7項引入logistic模型，顯示遠處轉移、HLA-I表達是鼻咽癌獨立預后因素。HLA-I分子表達下調導致鼻咽癌患者生存率下降，這與其他研究者結果相一致[11-15]。提示HLA-I分子參與的腫瘤細胞免疫發(fā)揮著關鍵性作用， HLA-I分子表達下調或缺失將預示著患者的預后不良。

本研究提示我們在臨床治療中檢測HLA-I分子的表達將可能作為鼻咽癌預后不良因素的指標之一。HLA-I分子低表達的鼻咽癌患者預示著將接受更加有力的治療方案。同時，可以提高患者HLA-I分子表達的生物治療也可作為該類患者的治療選擇。

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