陳永勝等

摘要：褐化很大程度上限制了蓖麻花藥增殖培養(yǎng)研究，本研究通過改變蓖麻花藥愈傷組織的培養(yǎng)基成分、添加防褐劑來建立高效增殖體系，最終確定蓖麻花藥愈傷增殖最佳培養(yǎng)基為1/2MS+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+NAA 0.3 mg/L+ZT 5.0 mg/L+脯氨酸750 mg/L+酸性水解酪蛋白750 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+維生素C 400 mg/L+活性炭 0.6 mg/L，pH值=5.8。

關(guān)鍵詞：蓖麻；花藥；愈傷組織增殖；防褐化

中圖分類號： S565.604.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0046-02

收稿日期：2013-08-02

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31060194）。

作者簡介：陳永勝（1971—），男，內(nèi)蒙古通遼人，博士，教授，主要從事作物生物技術(shù)研究。Tel：（0475）8314624；E-mail：chenys-2012@hotmail.com。蓖麻（Ricinus communis L.）為一年生或多年生雙子葉植物，其副產(chǎn)品多用于航空航天、化工、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等，市場潛力較大[1]。我國是蓖麻種植第二大國，但蓖麻新品種的開發(fā)一直處于落后水平，近年來才將現(xiàn)代生物技術(shù)應(yīng)用于蓖麻育種[2-3]。蓖麻花藥立體培養(yǎng)所得的植株都是純系，自交后代不發(fā)生性狀分離，在育種上有很高的應(yīng)用價值。國內(nèi)蓖麻花藥培養(yǎng)研究起步較晚，且褐化一直是花藥培養(yǎng)過程中的難題，主要表現(xiàn)外植體增殖、誘導(dǎo)初分化或是再分化過程中，自身組織會向培養(yǎng)基釋放褐色物質(zhì)導(dǎo)致培養(yǎng)基逐漸變褐，外植體也隨之死亡[4-5]。褐化很大程度上限制了蓖麻花藥離體培養(yǎng)的效率，除了本身基因型的差異外，可添加防褐物、調(diào)整培養(yǎng)基成分、改變培養(yǎng)環(huán)境等來防止褐化[6-7]。本研究通過改變蓖麻花藥愈傷增殖過程中培養(yǎng)基條件、添加褐化抑制劑，以期有效降低褐化率，建立高質(zhì)量的蓖麻花藥培養(yǎng)體系。

1材料與方法

1.1試驗材料

通蓖5號蓖麻花藥，采自內(nèi)蒙古民族大學(xué)試驗農(nóng)場。在溫度較低、日照較弱時，取健壯無病植株上尚未張開且呈淡黃色的蓖麻花蕾。

1.2試驗方法

1.2.1蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)參照黃鳳蘭等研究成果[8-10]。4 ℃預(yù)處理花蕾5 d，流水沖洗30 min，無菌條件下用75%乙醇消毒30 s，HgCl2消毒2 min，無菌水沖洗5次，最后轉(zhuǎn)至鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中。愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+脯氨酸750 mg/L+NAA 0.9 mg/L+6-BA 1.5 mg/L+酸性水解酪蛋白 750 mg/L+抗壞血酸100 mg/L，pH值=5.8。將3/5個花蕾花藥均勻分至培養(yǎng)基表面進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，約230個/瓶。

1.2.2愈傷組織增殖防褐化篩選篩選“1.2.1”節(jié)結(jié)果中直徑為3 mm左右、淡綠色致密型的花藥愈傷組織，進(jìn)行防褐化篩選。每瓶培養(yǎng)基接種愈傷23粒，2次重復(fù)，15 d后統(tǒng)計褐化率、增殖率。（1）無機鹽濃度篩選：篩選培養(yǎng)基中的無機鹽濃度（MS、1/2 MS、1/4 MS、1/8 MS、1/16MS），建立適宜的愈傷組織增殖無機鹽環(huán)境。（2）PGR條件篩選：篩選培養(yǎng)基中最佳激素NAA（01、0.3、0.5 mg/L）、ZT（3.0、5.0、7.0 mg/L）、6-BA（0、10、2.0 mg/L）濃度，以提高愈傷增殖的效率。（3）維生素C濃度篩選：添加不同濃度的防褐添加劑維生素C（0、200、400、600、800 mg/L），篩選最適維生素C濃度。（4）活性炭濃度篩選：添加不同濃度的防褐添加劑活性炭（0、03、0.6、0.9、1.2 g/L），篩選最適活性炭濃度。

1.2.3統(tǒng)計方法

1.2.3.1愈傷組織增殖率

愈傷組織增殖率=（m3-m2） -（m1-m0）/（m1-m0）×100%。

式中：m0為繼代前培養(yǎng)基與培養(yǎng)容器質(zhì)量；m1為繼代后培養(yǎng)基、培養(yǎng)容器與愈傷組織質(zhì)量；m2為第2次繼代前培養(yǎng)基與培養(yǎng)容器質(zhì)量；m3為第2次繼代后培養(yǎng)基、培養(yǎng)容器與愈傷組織質(zhì)量。

1.2.3.2愈傷組織褐化程度統(tǒng)計依次用“+”“++”“+++”“++++”“+++++”表示褐化程度，其中“+++++”褐化最嚴(yán)重；依次用“*”“**”“***”“****”調(diào)節(jié)褐化程度。

2結(jié)果與分析

2.1花藥愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果

花藥愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果如圖1所示，其中多為淺綠色的致密型愈傷，且褐化不明顯。選取其中直徑為3 mm左右的愈傷組織進(jìn)行增殖培養(yǎng)。

2.2愈傷組織增殖防褐化篩選結(jié)果

2.2.1無機鹽濃度篩選結(jié)果由表1可知，當(dāng)無機鹽濃度為1/2MS時，愈傷增殖率高達(dá)29.06%；在各個無機鹽濃度下，愈傷組織的褐化率變化不大。

3結(jié)論與討論

褐化是蓖麻花藥培養(yǎng)的主要限制因素，最初愈傷為棕黃色，轉(zhuǎn)為深褐色后停止生長，最后逐漸死亡。本研究通過改變愈傷組織的培養(yǎng)基成分、添加防褐劑來建立高效蓖麻花藥愈傷增殖體系，當(dāng)添加400 mg/L維生素C、0.6 g/L活性炭時對增殖培養(yǎng)過程中的愈傷組織起到了積極的防褐作用。最終確定最佳培養(yǎng)基組合為1/2MS+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+脯氨酸750 mg/L+酸性水解酪蛋白750 mg/L+NAA 0.3 mg/L+ZT 5.0 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+維生素C 400 mg/L+活性炭 0.6 mg/L，pH值=5.8。

維生素C可作為抗氧化劑阻止褐變的發(fā)生[11]，但目前維生素C降低愈傷組織褐化率的機理尚不明確，有待進(jìn)一步研究。近年來對活性炭促進(jìn)花藥離體培養(yǎng)的報道較多[12-13]，當(dāng)花藥離體培養(yǎng)時，由于新陳代謝紊亂，會產(chǎn)生多種不利于生長或是有毒的酚類等物質(zhì)，活性炭具有較強的吸附特性且無選擇性，從而有利于花藥培養(yǎng)進(jìn)程[14]。但筆者發(fā)現(xiàn)，活性炭僅在一定濃度范圍內(nèi)降低愈傷組織的褐化程度；當(dāng)超過一定濃度后，反而不利于愈傷組織生長和防褐化，可能是由于吸附了培養(yǎng)基中的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，其中鐵鹽、維生素等與花藥培養(yǎng)與分化密切相關(guān)。由于活性炭吸附的雙重性，所以其調(diào)控花藥愈傷生長及防褐化的作用也是雙面的， 更應(yīng)深入研究其最合

適的作用濃度，以建立更加快捷的蓖麻花藥愈傷增殖培養(yǎng)方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]鄭鷺，祁建民，陳紹軍，等. 蓖麻遺傳育種進(jìn)展及其在生物能源與醫(yī)藥綜合利用潛勢[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2006，22（9）：109-113.

[2]陳永勝，王永佳，王瑩，等. 蓖麻毒蛋白A鏈基因RNAi轉(zhuǎn)化研究[J]. 西北植物學(xué)報，2013，33（1）：39-42.

[3]王文躍，李國瑞，黃鳳蘭，等. 蓖麻莖稈 cDNA-AFLP 反應(yīng)體系的建立[J]. 華北農(nóng)學(xué)報，2013，28（2）：86-90.

[4]代建麗，宋嬋嬋，徐晨，等. 庫拉索蘆薈組織培養(yǎng)褐化現(xiàn)象的抑制研究[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報，2013，19（6）：23-24.

[5]鄭穎，秦紅玫，黎云祥. 臺灣榿木組織培養(yǎng)中污染和褐化的防止[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（2）：64-65，117.

[6]徐耀華，楊春華，劉曉波，等. 扁穗牛鞭草組織培養(yǎng)中褐化控制技術(shù)初探[J]. 草業(yè)科學(xué)，2013，30（2）：212-217.

[7]楊亞萍，鄭新強. 茶樹組織培養(yǎng)中的褐化控制研究[J]. 茶葉，2013，39（1）：3-7.

[8]黃鳳蘭，薩日娜，孟凡娟，等. 蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)的研究[J]. 作物雜志，2009（6）：59-63，后插1.

[9]邵志敏，陳永勝，黃鳳蘭，等. 低溫預(yù)處理與光照條件對蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J]. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012，27（2）：189-193.

[10]李國瑞，黃鳳蘭，王文躍，等. 蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)條件優(yōu)化[J]. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012，27（6）：670-673.

[11]劉強，張春慶，鞏東營. 玉米花藥培養(yǎng)中影響褐變的幾個因素的初步研究[J]. 玉米科學(xué)，2005，13（1）：39-40，43.

[12]錢春艷，曹有龍，段安安，等. 枸杞花藥培養(yǎng)若干影響因子的研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（6）：76-78.

[13]Gland A，Lichter R，Schweiger H G. Genetic and exogenous factors affecting embryogenesis in isolated microspore cultures of Brassica napus L.[J]. Journal of Plant Physiology，1988，132（5）：613-617.

[14]Johansson L B，Calleberg E，Gedin A. Correlations between activated charcoal，F(xiàn)e-EDTA and other organic media ingredients in cultured anthers of Anemone canadensis[J]. Physiologia Plantarum，1990，80（2）：243-247.

適的作用濃度，以建立更加快捷的蓖麻花藥愈傷增殖培養(yǎng)方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]鄭鷺，祁建民，陳紹軍，等. 蓖麻遺傳育種進(jìn)展及其在生物能源與醫(yī)藥綜合利用潛勢[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2006，22（9）：109-113.

[2]陳永勝，王永佳，王瑩，等. 蓖麻毒蛋白A鏈基因RNAi轉(zhuǎn)化研究[J]. 西北植物學(xué)報，2013，33（1）：39-42.

[3]王文躍，李國瑞，黃鳳蘭，等. 蓖麻莖稈 cDNA-AFLP 反應(yīng)體系的建立[J]. 華北農(nóng)學(xué)報，2013，28（2）：86-90.

[4]代建麗，宋嬋嬋，徐晨，等. 庫拉索蘆薈組織培養(yǎng)褐化現(xiàn)象的抑制研究[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報，2013，19（6）：23-24.

[5]鄭穎，秦紅玫，黎云祥. 臺灣榿木組織培養(yǎng)中污染和褐化的防止[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（2）：64-65，117.

[6]徐耀華，楊春華，劉曉波，等. 扁穗牛鞭草組織培養(yǎng)中褐化控制技術(shù)初探[J]. 草業(yè)科學(xué)，2013，30（2）：212-217.

[7]楊亞萍，鄭新強. 茶樹組織培養(yǎng)中的褐化控制研究[J]. 茶葉，2013，39（1）：3-7.

[8]黃鳳蘭，薩日娜，孟凡娟，等. 蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)的研究[J]. 作物雜志，2009（6）：59-63，后插1.

[9]邵志敏，陳永勝，黃鳳蘭，等. 低溫預(yù)處理與光照條件對蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J]. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012，27（2）：189-193.

[10]李國瑞，黃鳳蘭，王文躍，等. 蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)條件優(yōu)化[J]. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012，27（6）：670-673.

[11]劉強，張春慶，鞏東營. 玉米花藥培養(yǎng)中影響褐變的幾個因素的初步研究[J]. 玉米科學(xué)，2005，13（1）：39-40，43.

[12]錢春艷，曹有龍，段安安，等. 枸杞花藥培養(yǎng)若干影響因子的研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（6）：76-78.

[13]Gland A，Lichter R，Schweiger H G. Genetic and exogenous factors affecting embryogenesis in isolated microspore cultures of Brassica napus L.[J]. Journal of Plant Physiology，1988，132（5）：613-617.

[14]Johansson L B，Calleberg E，Gedin A. Correlations between activated charcoal，F(xiàn)e-EDTA and other organic media ingredients in cultured anthers of Anemone canadensis[J]. Physiologia Plantarum，1990，80（2）：243-247.

適的作用濃度，以建立更加快捷的蓖麻花藥愈傷增殖培養(yǎng)方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]鄭鷺，祁建民，陳紹軍，等. 蓖麻遺傳育種進(jìn)展及其在生物能源與醫(yī)藥綜合利用潛勢[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2006，22（9）：109-113.

[2]陳永勝，王永佳，王瑩，等. 蓖麻毒蛋白A鏈基因RNAi轉(zhuǎn)化研究[J]. 西北植物學(xué)報，2013，33（1）：39-42.

[3]王文躍，李國瑞，黃鳳蘭，等. 蓖麻莖稈 cDNA-AFLP 反應(yīng)體系的建立[J]. 華北農(nóng)學(xué)報，2013，28（2）：86-90.

[4]代建麗，宋嬋嬋，徐晨，等. 庫拉索蘆薈組織培養(yǎng)褐化現(xiàn)象的抑制研究[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報，2013，19（6）：23-24.

[5]鄭穎，秦紅玫，黎云祥. 臺灣榿木組織培養(yǎng)中污染和褐化的防止[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（2）：64-65，117.

[6]徐耀華，楊春華，劉曉波，等. 扁穗牛鞭草組織培養(yǎng)中褐化控制技術(shù)初探[J]. 草業(yè)科學(xué)，2013，30（2）：212-217.

[7]楊亞萍，鄭新強. 茶樹組織培養(yǎng)中的褐化控制研究[J]. 茶葉，2013，39（1）：3-7.

[8]黃鳳蘭，薩日娜，孟凡娟，等. 蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)的研究[J]. 作物雜志，2009（6）：59-63，后插1.

[9]邵志敏，陳永勝，黃鳳蘭，等. 低溫預(yù)處理與光照條件對蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J]. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012，27（2）：189-193.

[10]李國瑞，黃鳳蘭，王文躍，等. 蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)條件優(yōu)化[J]. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012，27（6）：670-673.

[11]劉強，張春慶，鞏東營. 玉米花藥培養(yǎng)中影響褐變的幾個因素的初步研究[J]. 玉米科學(xué)，2005，13（1）：39-40，43.

[12]錢春艷，曹有龍，段安安，等. 枸杞花藥培養(yǎng)若干影響因子的研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（6）：76-78.

[13]Gland A，Lichter R，Schweiger H G. Genetic and exogenous factors affecting embryogenesis in isolated microspore cultures of Brassica napus L.[J]. Journal of Plant Physiology，1988，132（5）：613-617.

[14]Johansson L B，Calleberg E，Gedin A. Correlations between activated charcoal，F(xiàn)e-EDTA and other organic media ingredients in cultured anthers of Anemone canadensis[J]. Physiologia Plantarum，1990，80（2）：243-247.