辣椒花藥開放式培養(yǎng)及不同基因型對(duì)花藥培養(yǎng)的影響

楊博智，周書棟，董亞靜，劉榮云，歐立軍，劉 峰，鄭井元，馬艷青*

（1.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，湖南 長沙 410125； 2.湖南湘研種業(yè)有限公司，湖南 長沙 410100）

辣椒（Capsicum annuumL.）是一種重要的蔬菜作物，適應(yīng)性很強(qiáng)，廣泛栽培于世界各地。近年來，我國辣椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，辣椒種植面積基本穩(wěn)定在150萬～200萬hm2，居蔬菜種植首位[1]。創(chuàng)制優(yōu)異種質(zhì)資源是選育辣椒新品種的重要基礎(chǔ)，而花藥培養(yǎng)是創(chuàng)新種質(zhì)資源的一種重要手段，不僅能縮短常規(guī)雜交育種所需的年限，提高選種效率，而且還能充分表現(xiàn)各種配子組合的基因型類型，在育種和基因工程研究中都具有很大的潛力。辣椒花藥培養(yǎng)研究開始較早，采用花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株的報(bào)道較多[2-6]。我國應(yīng)用花藥培養(yǎng)技術(shù)選育出的海花系列花藥培養(yǎng)辣椒品種已應(yīng)用推廣。

對(duì)辣椒花藥進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，用于單倍體培養(yǎng)的花蕾的花萼與花瓣齊平（此時(shí)小孢子處于單核靠邊期），常規(guī)滅菌方式無法對(duì)花萼與花瓣間隙中的細(xì)菌徹底滅菌，接種后花藥染菌率仍然居高不下；特別是中國南方地區(qū)，由于夏季高溫多雨，各種菌類大量滋生，雖然此時(shí)的辣椒花藥最適宜誘導(dǎo)胚狀體產(chǎn)生，但過高的污染率導(dǎo)致了花藥培養(yǎng)效率變低。常規(guī)辣椒花藥接種方法是在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，用尖頭鑷子挑開滅菌后的花蕾，夾取花藥接種至培養(yǎng)基中。辣椒花藥較?。ɑㄋ帉? mm左右），鑷子夾取花藥易夾傷或夾死花藥，且該方法耗時(shí)長，所需人工成本高。另外，基因型特異性強(qiáng)也是限制花藥培養(yǎng)技術(shù)在辣椒遺傳改良中廣泛應(yīng)用的因素[7-9]。

本研究通過改進(jìn)花蕾滅菌和花藥接種方式，以及往培養(yǎng)基中添加抑菌劑，簡(jiǎn)化了花藥培養(yǎng)技術(shù)流程，既能提高花藥培養(yǎng)操作效率，又有效降低了花藥染菌率；同時(shí)，采用該方法比較23個(gè)辣椒品種進(jìn)行的花藥培養(yǎng)效果，篩選出高再生頻率的辣椒品種，以期為提高辣椒花藥培養(yǎng)效率，加快辣椒花藥培養(yǎng)技術(shù)的實(shí)用化奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

辣椒品種為博辣紅牛、博辣5號(hào)、博辣8號(hào)、博辣紅艷、博辣瑞美、基地火辣、金線王、博辣紅星、興蔬綠劍、H15、215、博辣天星、新粗條椒、綠金線、春研13號(hào)、37-74、908、福湘錦繡、福湘佳玉、恒豐圣美、辣八螺絲王、久保田、新優(yōu)早王，均由湖南省蔬菜研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 辣椒花藥培養(yǎng)的方法探討

1.2.1.1 花蕾滅菌 于博辣紅?，F(xiàn)蕾期，采集花萼與花瓣齊平或花萼微露出花瓣的花蕾，放入自封口袋。置于4 ℃冰箱中低溫預(yù)處理 48 h。取出花蕾，分成2份，一份直接用于滅菌，另一份用尖頭鑷子繞離花蕾頂端約3/4處輕輕劃圈，剝?nèi)セɡ夙敳康幕ㄝ?，露出青綠色花瓣，再滅菌。滅菌方式為將花蕾置于50%的84滅菌液中滅菌10 min，再用無菌水沖洗2～3次?；ㄋ幗臃N采取用鑷子夾取的常規(guī)方法。接種14 d后統(tǒng)計(jì)花藥染菌率和死亡率，確定最佳滅菌方式。

1.2.1.2 花藥接種 對(duì)剝?nèi)?/4花萼再用50%的84滅菌液消毒10 min的花蕾，采用2種方式接種花藥。處理組用浸泡在75%酒精中的鑷子尖微微挑開花瓣，再徒手輕輕擠壓花瓣，使花藥自然脫落于培養(yǎng)基表面；對(duì)照組采用鑷子直接夾取花藥接種至培養(yǎng)基表面。接種14 d后統(tǒng)計(jì)花藥染菌率、死亡率，確定最佳滅菌方式。

1.2.1.3 抑菌劑種類和濃度選擇 選擇兩性霉素B和氨芐青霉素作為抑菌劑。兩性霉素B和氨芐青霉素濃度處理見表1。將博辣紅?；ㄋ幏謩e接種至添加0.5 mg/L KT、2.5 mg/L NAA、不同種類和濃度抑菌劑的NTH培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱中（35.0±0.5）℃黑暗培養(yǎng) 8 d，再轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室（25.0±0.5）℃暗培養(yǎng)至有白色胚狀體產(chǎn)生。培養(yǎng)8 d后觀察花藥染菌率和死亡率，并將未染菌的花藥重新接種至上述培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)30 d后，觀察愈傷組織、胚狀體誘導(dǎo)情況。篩選合適的抑菌劑及其適宜濃度。

1.2.2 花藥培養(yǎng)技術(shù)在不同辣椒品種中的應(yīng)用

取不同基因型辣椒品種（23個(gè)）花蕾，并采用優(yōu)化后的滅菌方式進(jìn)行滅菌，再將其接種至添加最佳抑菌劑濃度的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30 d后，觀察花藥褐化及愈傷組織、胚狀體誘導(dǎo)情況。篩選出高再生頻率的辣椒品種。

1.3 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計(jì)指標(biāo)及計(jì)算公式為：花藥染菌率=染菌的花藥數(shù)目/接種的花藥數(shù)目×100%；花藥褐化率=褐化的花藥數(shù)目/接種的花藥數(shù)目×100%；死亡率=死亡的花藥數(shù)目/接種的花藥數(shù)目×100%；愈傷組織誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷組織的花藥數(shù)目/接種的花藥數(shù)目×100%；胚狀體誘導(dǎo)率=產(chǎn)生胚狀體的花藥數(shù)目/接種的花藥數(shù)目×100%。

所有試驗(yàn)處理重復(fù)3次，結(jié)果取其平均值。數(shù)據(jù)采用Excel軟件做圖，SPSS16.0軟件分析顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒花藥培養(yǎng)方法探析

2.1.1 兩種花蕾滅菌方式比較

由表2可知，對(duì)剝?nèi)?/4花萼的花蕾滅菌時(shí)更易殺死花蕾表面細(xì)菌和內(nèi)生菌。接種14 d后發(fā)現(xiàn)，與不剝?nèi)セㄝ嘞啾龋瑒內(nèi)?/4花萼處理中花藥染菌率顯著降低，降幅為66.48%；花藥褐化率和花藥死亡率增加，但差異不顯著。由此可知，采用剝?nèi)?/4花萼的花蕾進(jìn)行滅菌是合適的處理方式。

表1 抑菌劑種類及濃度處理mg/L

表2 花蕾滅菌處理對(duì)博辣紅?；ㄋ幦揪省⒑只始八劳雎实挠绊?

2.1.2 兩種花藥接種方式比較

由表3可知，與鑷子夾取花藥相比，徒手?jǐn)D壓對(duì)花藥傷害小。接種14 d后觀察，徒手?jǐn)D壓花藥處理，花藥死亡率和愈傷組織誘導(dǎo)率極顯著低于鑷子夾取處理，其降幅分別達(dá)80.36%、80.04%，說明鑷子夾取花藥易夾死或夾傷花藥，導(dǎo)致花藥產(chǎn)生愈傷組織或死亡，而徒手?jǐn)D壓花藥則可降低對(duì)花藥的傷害；褐化率降低，但與鑷子夾取處理差異不顯著；花蕾接種速度為鑷子夾取處理的2.18倍，說明徒手?jǐn)D壓花藥省時(shí)、省工，可有效降低人工成本。

2.1.3 抑菌劑種類和濃度對(duì)花藥培養(yǎng)的影響

由表4可知，氨芐青霉素和兩性霉素B均可顯著降低花藥染菌率。2種抑菌劑合用比單獨(dú)使用一種抑菌劑效果更佳；高濃度抑菌劑雖然可以有效降低花藥染菌率，但也同時(shí)顯著提高了花藥死亡率、愈傷組織誘導(dǎo)率，抑制了胚狀體的誘導(dǎo)。往培養(yǎng)基中同時(shí)添加25 mg/L的氨芐青霉素和25 mg/L的兩性霉素B，培養(yǎng)8 d后觀察到花藥染菌率為1.42%，死亡率為3.89%；培養(yǎng)30 d后，愈傷組織誘導(dǎo)率為13.51%，胚狀體誘導(dǎo)率為3.87%，由此說明，25 mg/L的氨芐青霉素和25 mg/L的兩性霉素B適宜于辣椒花藥培養(yǎng)。

2.2 花藥培養(yǎng)技術(shù)在不同基因型辣椒品種中的應(yīng)用效果

由圖1可知，花藥培養(yǎng)時(shí)，花藥受損易產(chǎn)生愈傷組織（圖1A），胚狀體誘導(dǎo)受抑制。觀察到的胚狀體包括子葉形胚和畸形胚（球形胚、含根毛的胚）2種類型。子葉形胚（圖1G）可直接分化成苗，而球形胚、畸形胚狀體繼續(xù)培養(yǎng)雖可以生根，但因缺乏生長點(diǎn)而無法成苗（圖1B、C、D、 E、F）。

表3 兩種接種方式對(duì)博辣紅?；ㄋ幣囵B(yǎng)及花蕾接種速度的影響

表4 氨芐青霉素和兩性霉素B處理對(duì)博辣紅?；ㄋ幣囵B(yǎng)的影響%

圖1 花藥培養(yǎng)胚狀體情況

表4 不同基因型辣椒品種花藥胚狀體和單倍體植株誘導(dǎo)情況%

由表4可知，基因型不同，花藥胚誘導(dǎo)率均存在差異。23個(gè)基因型中，子葉形胚狀體誘導(dǎo)率在0.00%～6.71%，畸形胚狀體為0.00%～2.76%。11個(gè)辣椒品種能夠同時(shí)產(chǎn)生子葉形胚狀體和畸形胚狀體，5個(gè)辣椒品種僅能產(chǎn)生畸形胚。其中博辣紅牛、H15、辣八螺絲王的花藥的子葉形胚狀體誘導(dǎo)率大于5%，滿足種質(zhì)創(chuàng)新條件。

3 結(jié)論與討論

目前，大多辣椒花藥培養(yǎng)文獻(xiàn)報(bào)道均采用花蕾直接滅菌，由于花萼與花瓣間隙中的細(xì)菌難以徹底殺死，接種后花藥染菌率仍然居高不下。本試驗(yàn)剝?nèi)セɡ?/4的萼片再進(jìn)行滅菌，花藥染菌率降低至5%以下，說明該方法更易殺死花蕾表面細(xì)菌和內(nèi)生菌，具有可行性。

常規(guī)的花藥培養(yǎng)基需要高壓滅菌，接種需要在超凈工作臺(tái)中用鑷子夾取花藥轉(zhuǎn)至培養(yǎng)基表面。該方法需要特定的試驗(yàn)環(huán)境，且由于辣椒花藥小，接種花藥費(fèi)時(shí)費(fèi)工，難以進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。其他植物進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，研究者們提出了一種新的組織培養(yǎng)方法，即通過往培養(yǎng)基中添加抑菌劑，使植物組織培養(yǎng)脫離嚴(yán)格無菌的操作環(huán)境進(jìn)行組織培養(yǎng)的一種方法，稱之為開放式組織培養(yǎng)[10-11]。目前，已廣泛應(yīng)用于葡萄、香蕉、煙草等植物的組織培養(yǎng)中[12-14]。在開放組織培養(yǎng)過程中，添加了抑菌劑的培養(yǎng)基不需要在高溫高壓下進(jìn)行滅菌，接種外植體也不需要在超潔凈的工作臺(tái)上進(jìn)行；因此，該方法從根本上簡(jiǎn)化了組織培養(yǎng)環(huán)節(jié)，降低了成本。

本研究中，選擇氨芐青霉素和兩性霉素B作為抑菌劑，用于在開放條件下博辣紅牛花藥培養(yǎng)。結(jié)果顯示，25 mg/L的氨芐青霉素和25 mg/L的兩性霉素B適宜用于辣椒花藥培養(yǎng)，花藥染菌率1.42%，死亡率為3.89%，愈傷組織誘導(dǎo)率為13.51%，胚狀體誘導(dǎo)率為3.87%，由此說明，25 mg/L的氨芐青霉素和25 mg/L的兩性霉素B適宜于用做開放式培養(yǎng)抑菌劑。此外，還改進(jìn)了花藥接種方式，試驗(yàn)結(jié)果表明：徒手?jǐn)D壓花藥可降低對(duì)花藥的傷害，花藥接種速度與傳統(tǒng)方法相比可提高2.18倍，說明徒手?jǐn)D壓花藥省時(shí)、省工，可有效降低人工成本。

作物花藥胚狀體誘導(dǎo)率與基因型密切相關(guān)。辣椒花藥培養(yǎng)受基因型、生長環(huán)境、植株?duì)顟B(tài)、培養(yǎng)基成分等多種因素的影響，基因型是影響辣椒花藥培養(yǎng)的重要因素之一[15]。本研究也表明不同基因型間花藥胚狀體誘導(dǎo)率存在差異，且從23個(gè)基因型品種中篩選到了3個(gè)高誘導(dǎo)頻率的辣椒品種，其胚狀體誘導(dǎo)率大于5%，可滿足種質(zhì)創(chuàng)新條件。