楊君，王建華，劉靖靖，李立，顏冬云

（1.青島大學，山東青島 266071； 2.山東出入境檢驗檢疫局，山東青島 266002；3.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100123）

高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜法快速篩查飲料中6種人工合成甜味劑*

楊君1，2，王建華2，劉靖靖2，李立3，顏冬云1

（1.青島大學，山東青島 266071； 2.山東出入境檢驗檢疫局，山東青島 266002；3.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100123）

建立了高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質譜快速檢測飲料中糖精鈉、甜蜜素、安賽蜜、阿斯巴甜、紐甜、三氯蔗糖6種人工合成甜味劑的方法。樣品經(jīng)水提取，采用C18色譜柱，以甲醇和0.1%甲酸-10 mmol／L甲酸銨溶液為流動相，梯度洗脫，四極桿飛行時間串聯(lián)質譜電噴霧負離子模式檢測。各化合物在0.02～2.0 mg／L范圍內均呈現(xiàn)良好的線性關系，相關系數(shù)均大于0.998。樣品平均添加回收率為63.0%～113.2%，測定結果的相對標準偏差均小于9.6%(n=5)。該方法簡便快捷，選擇性好，靈敏度高，可滿足國內外現(xiàn)行法規(guī)的限量要求。

液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質譜；人工合成甜味劑；篩查；飲料

甜味劑是一類重要的食品添加劑，按其來源可以分為天然甜味劑和人工合成甜味劑。人工合成甜味劑在人體內不進行代謝吸收，用量小，不提供熱量或產(chǎn)生的熱量少而甜度高，因而被廣泛應用于食品飲料中［1］。多數(shù)國家批準使用的品種主要有安賽蜜、阿斯巴甜、甜蜜素、糖精、三氯蔗糖等［2］。科學研究表明，人工合成甜味劑能致使某些動物產(chǎn)生腫瘤，因此為避免其對人體產(chǎn)生潛在危險，必須限制食品飲料中甜味劑的用量。

美國、歐盟、日本等國對食品中甜味劑的使用有嚴格規(guī)定［3］，我國衛(wèi)生部發(fā)布的GB 2760-2011《食品添加劑使用標準》中規(guī)定，飲料中安賽蜜的限量為0.3 g／kg，糖精鈉為0.15 g／kg，甜蜜素為0.65 g／kg，三氯蔗糖為0.25 g／kg，阿斯巴甜和紐甜可在任何食品中按需使用。食品中甜味劑的檢測方法［4］主要有高效液相色譜法［5-6］、液相色譜-質譜法［7-8］、液相色譜-串聯(lián)質譜法［9-11］、氣相色譜法［12-13］等。

四極桿飛行時間質譜(Q TOF MS)屬于高分辨質譜，可根據(jù)化合物及碎片離子的精確質量對其進行定性分析，增加了定性的準確度。使用液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質譜檢測飲料中甜味劑的國外報道較少［14］，國內則未見報道。筆者用高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質譜(HPLC-Q TOF MS)分析技術，建立了飲料中糖精鈉、甜蜜素、安賽蜜、阿斯巴甜、紐甜、三氯蔗糖6種常用人工合成甜味劑的檢測方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀（Agilent 1200型）／四極桿飛行時間串聯(lián)質譜儀（6520 Accurate Mass型）：美國Agilent公司；

電子天平：PL303型，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-500DB型，昆山市超聲儀器有限公司；

乙腈、甲酸、乙酸銨、甲酸銨：色譜純，美國Honeywell Burdick &Jackson Muskegon公司；

安 賽 蜜(Acesulfame-K)、糖 精 鈉(Sodium Saccharin)、甜 蜜 素 (Cyclamate)、三 氯 蔗 糖(Sucralose)、阿斯巴甜(Aspartame)、紐甜(Neotame)標準物質：純度均為99.0%，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；

實驗室用水由Milli-Q純水系統(tǒng)制備。

1.2 標準溶液的配制

稱取上述標準品各0.050 0 g于50 mL棕色容量瓶中，用純水溶解并定容，配制成1 mg／mL的混合標準儲備液，置于冰箱中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Eclispe XDB-C18柱(150 mm×2.1 mm，5 μm，美國Agilent公司)，卡套式保護柱(C18填料)；柱溫：30℃；進樣體積：5 μL；流動相：A為甲醇，B為0.1%甲酸-10 mmol／L甲酸銨溶液；梯度洗脫程序：0～1.0 min為98% B，1.0～5.0 min由98% B降至20% B，5.0～7.0 min為20% B，7.0～20.0 min為98% B；流速：0.3 mL／min。

1.3.2 Q TOF MS條件

電噴霧源(ESI)負離子模式；干燥氣：氮氣，溫度為350℃，流量為11 L／min；霧化氣壓力：275.8 kPa(40 psi)；毛細管電壓：4 000 V；傳輸電壓：140 V；掃描模式：全掃描；掃描范圍：m／z 100～1 100；參比離子：m／z 121.985 6，1 033.988 1。

1.4 實驗方法

取1.0 mL樣品至50 mL容量瓶中，用純水定容至標線，超聲提取20 min，過0.22 μm尼龍濾膜，濾液供HPLC-Q TOF MS測定。

2 結果與討論

2.1 分析條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜流動相的優(yōu)化

對色譜流動相進行了優(yōu)化，考察了甲醇-乙酸銨-甲酸和甲醇-甲酸銨-甲酸體系，發(fā)現(xiàn)甲醇-乙酸銨-甲酸體系下阿斯巴甜響應稍高，但安塞蜜和糖精鈉的響應較低，并且峰形對稱性差；甲醇-甲酸銨-甲酸體系分離響應較好，故選擇甲醇-甲酸銨-甲酸水溶液作為色譜流動相。

采取大梯度的洗脫方式，即起始為98%水相，在5 min內變化到20%水相，盡可能使各種化合物在較短的時間內分離。同時考察了流動相A和B的比例，試驗發(fā)現(xiàn)，流動相A和B的比例改變對安賽蜜、糖精鈉和甜蜜素的測定結果影響較小，在一定時間內均會出峰；但流動相A和B的比例不恰當會導致出現(xiàn)三氯蔗糖、阿斯巴甜和紐甜不出峰或峰形很差的情況。

2.1.2 離子化模式的優(yōu)化

在優(yōu)化的色譜條件下，對比了ESI+和ESI-兩種模式對6種甜味劑質譜響應的影響。試驗結果表明，紐甜、三氯蔗糖、阿斯巴甜在正、負模式下均有響應，且正模式的響應要比負模式強；糖精鈉、甜蜜素、安賽蜜3種化合物在正模式下沒有響應?？紤]到正負離子模式頻繁轉換易造成儀器不穩(wěn)定，而6種甜味劑在負模式下響應均能滿足要求，故實驗選擇ESI-模式下檢測6種甜味劑。

5)旅游設施和管理缺失。由于森林古道地理位置特殊，尤以海拔較高處管理相對薄弱，缺乏相應的旅游設施，游客上山所攜帶的食品包裝成為隨處可見的垃圾。部分游客在人文古跡上亂涂亂畫，另有游客進行燒烤野炊等污染環(huán)境的行為。

2.1.3 傳輸電壓的優(yōu)化

傳輸電壓是HPLC-TOF MS的一項關鍵參數(shù)，該參數(shù)對待測物的檢測靈敏度和特征離子碎片信息的豐富程度有直接影響，因此需要優(yōu)化傳輸電壓以使目標化合物產(chǎn)生最大響應信號且生成較少的碎片離子。在其它優(yōu)化條件下，著重考察從90 V到200 V的傳輸電壓。隨著電壓增大，甜味劑的響應值逐漸升高，到達某一電壓時最高；再升高電壓時，響應值降低或不變，綜合考慮選擇140 V作為最佳傳輸電壓。

2.2 HPLC-Q TOF MS定性分析

對樣品進行全掃描，利用分子離子精確質量的理論值與測量值的質量偏差小于5×10-6及特征碎片離子對化合物進行定性。

在優(yōu)化的色譜和質譜條件下對6種甜味劑進行分析，分子離子峰精確相對分子質量的理論值和測量值以及質量偏差列于表1?；贖PLC-Q TOF MS負離子掃描模式的6種甜味劑的分子特征離子提取色譜圖見圖1。

表1 各化合物母離子理論質荷比、實測質荷比及匹配結果

圖1 6種甜味劑的提取離子色譜圖

2.3 基質效應

基質是樣品中被分析物以外的組分，常對分析物的分析有顯著干擾，從而影響分析結果的準確性，這些影響和干擾被稱為基質效應［15］。為研究基質效應對測定結果的影響，取陰性果醋飲料、飲料及冰糖雪梨飲料按1.4實驗方法處理，用得到的溶液配制成2.0 mg／L混合標準溶液，與純水配制的2.0 mg／L的混合標準溶液進行比較。

式中：A——與基質相同體積純水處理后加入相同量標準品所測得峰面積；

B——基質處理后加入相同量標準品所測得峰面積。

根據(jù)式(1)，除果醋中的甜蜜素測定值增大80.1%、麥芽汁發(fā)酵飲品中的阿斯巴甜測定值增大了21.7%外，其余甜味劑的基質效應值均在±10%以內，尤其是陰性的冰糖雪梨飲料，其基質效應值在±8%以內，說明陰性樣品基質對樣品檢測的影響不大，因而在驗證方法可行性時采用陰性樣品提取液作為溶劑；而含有某種甜味劑的陽性樣品中該甜味劑會影響檢測結果。因此本方法最終采用基質匹配外標校準曲線對樣品中的甜味劑進行定量，以抵消基質效應的影響。

2.4 線性方程

6種甜味劑在0.02～2.0 mg／L濃度范圍內，標準溶液的質量濃度x與色譜峰面積y呈良好的線性關系(r≥0.998)，以6種甜味劑測量信噪比S／N=3時的進樣濃度定義為檢出限，結果列于表2。

表2 6種人工甜味劑的線性方程、相關系數(shù)及檢出限

2.5 回收試驗與精密度試驗

通過向陰性飲料樣品中添加低(0.1 mg／L)、中(0.5 mg／L)、高(1.0 mg／L)3個濃度水平的甜味劑混合標準溶液，進行回收試驗和精密度試驗，每個濃度樣品平行測定5次，測定結果見表3。由表3可見，6種甜味劑的回收率在63.0%～113.2%之間，相對標準偏差為1.2%～9.6%。

表3 6種人工甜味劑的添加回收率、精密度

2.6 實際樣品檢測

采用Aglient 公司的質譜分析軟件建立甜味劑的精確分子質量及Q TOF MS的數(shù)據(jù)庫，應用本方法對市售果醋、麥芽汁發(fā)酵飲品、奶茶、山楂果肉飲料、荔枝汁飲料、白蘭地、葡萄酒、白酒等進行檢測，檢測結果：果醋樣品中含安賽蜜314.6 mg／L、甜蜜素204.7 mg／L、阿斯巴甜161.8 mg／L；麥芽汁發(fā)酵飲品中含安賽蜜14.1 mg／L、阿斯巴甜11.5 mg／L；其余樣品均沒有檢出。

3 結語

建立了飲料中糖精鈉、甜蜜素、安賽蜜、阿斯巴甜、紐甜、三氯蔗糖6種人工合成甜味劑的高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質譜快速分析方法。樣品經(jīng)簡單的前處理，利用四極桿-飛行時間質譜的精確質量定性實現(xiàn)化合物的定性。本方法簡便快捷，靈敏度高，可滿足國內外現(xiàn)行法規(guī)的限量要求。

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Analysis of 6 Synthetic Sweeteners in Beverage by Liquid Chromatography-Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry

Yang Jun1，2, Wang Jianhua2, Liu Jingjing2, Li Li3, Yan Dongyun1
(1. Qingdao University, Qingdao 266071, China; 2. Shandong Entry-Exit Inspection Quarantine Bureau, Qingdao 266002, China; 3. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China)

A new method was established for the determination of 6 synthetic sweeteners (sodium saccharin, cyclamate, acesulfame-K, aspartame, neotame, sucralose) in beverage, by using high performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry (HPLC-Q TOF MS). The samples were extracted by water and measured directly by HPLC-Q TOF MS with electrospray ionization in negative mode. The compounds were separated by a C18column with methyl alcohol and 0.1% formic acid-10 mmol／L ammonium formate solution as the mobile phase. A detailed fragmentation study for 6 synthentic sweeteners was carried out by time of fl ight. The 6 compounds behave linearly in the range of 0.02-2.0 mg／L with the correlation coeff i cient of more than 0.998. The recoveries were 63.0%-113.2%, with coeff i cients of variation below 9.6%(n=5). The method is suitable for routine qualitative and quantitative analyses of synthetic sweeteners in beverage.

high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry; artificial sweeteners; screening; beverage

O657.7

A

1008-6145(2014)02-0009-04

10.3969／j.issn.1008-6145.2014.02.003

*國家質檢公益性行業(yè)科研項目（2012424012-2）

聯(lián)系人：李立；Email: whywrs9@163.com

2013-03-08