賈宏昉 張洪映 尹貴寧 黃化剛 徐國華 崔紅

（1.河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院 國家煙草栽培生理生化基地，鄭州 450002；2.貴州省煙草公司畢節(jié)市公司，畢節(jié) 551700；3.南京農(nóng)業(yè)大學資環(huán)學院，南京 210095）

磷是重要的植物營養(yǎng)元素，但是其在土壤中的有效性卻很低，因此土壤溶液中植物根系可吸收的有效磷濃度通常只有2-10 μmol/L，遠遠滿足不了植物的生長需要［1，2]。磷在土壤中的低有效性也誘導了植物在長期進化過程中形成了一系列適應低磷脅迫的機制［3]：（1）根系擴大生長，根毛數(shù)量增加；（2）增強碳代謝和一些磷酸酶及有機酸的分泌以活化土壤中的難溶性磷；（3）一系列與磷缺乏相關的基因誘導表達（主要為磷轉運蛋白）；其中，與磷酸鹽吸收直接相關的就是磷轉運蛋白，依據(jù)Km值的不同，磷轉運蛋白可以粗分為低親和力（Low Affinity）和高親和力（High Affinity）兩大運輸系統(tǒng)［4，5]。一般認為，高親和磷轉運蛋白（Pht1）家族是受磷營養(yǎng)缺乏而誘導的表達系統(tǒng)，Km值在微摩爾的范圍內，這與土壤中的有效磷濃度相當［4，6]，因此Pht1在植物吸收磷酸鹽過程中起主要作用。

水稻中共有13個高親和磷轉運蛋白家族成員［7]。OsPT8基因編碼的蛋白大小都約為58 kD，含有530個氨基酸殘基，由12個疏水的跨膜（TM）螺旋組成，每個跨膜螺旋包含有17-25個氨基酸殘基，在TM6和TM7有一個親水大環(huán)（Hydrophilic loop）將12個跨膜域分隔成兩組，即包括6個N端的跨膜區(qū)以及6個C端的跨膜區(qū)；蛋白的N端、C端及中間的親水大環(huán)都分布在細胞質中，為典型的質膜轉運蛋白拓撲結構［6，8]。前期的研究結果表明OsPT8雖然為組成型表達，但是仍受缺磷誘導表達增強，該基因在維持水稻體內磷素的動態(tài)平衡過程中起關鍵作用。在水稻中過量表達OsPT8基因造成水稻植株在正常供磷條件下葉片積累大量的磷，植株矮小，表現(xiàn)出“磷中毒”現(xiàn)象［8]。到目前為止關于OsPT8基因在雙子葉植物上的功能還不清楚。因此，本試驗將水稻高親和磷轉運蛋白基因OsPT8轉入雙子葉模式植物煙草中，研究OsPT8基因對煙草生長發(fā)育及耐低磷能力的影響，旨在從分子水平分析OsPT8基因在雙子葉植物中的功能，為培養(yǎng)磷高效作物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受體材料 煙草云煙87種子由本實驗室保藏。

1.1.2 基因、載體和菌株 水稻高親和磷轉運蛋白OsPT8基因、植物表達載體Psla-4、農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105均由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 煙草轉化及分子檢測［9]構建好的表達載體Ubi-Ps1a-4∷OsPT8通過電擊法轉化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞。將鑒定為陽性的農(nóng)桿菌侵染無菌的煙草葉片，侵染過的葉片置于培養(yǎng)基（MS+0.2 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA）上進行共培養(yǎng)，3 d后將其轉移到篩選培養(yǎng)基（MS+0.2 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA+100 mg/L Kan+500 mg/L Carb）中進行培養(yǎng)，光照周期為16 h光照/8 h黑暗，2-3周后將抗性芽切下并轉入生根培養(yǎng)基（MS+100 mg/L Kan+500 mg/L Carb）中誘導生根，最終獲得轉基因煙草。PCR鑒定轉化苗，所用鑒定引物為水稻OsPT8基因特異引物，引物序列見表1。

表1 相關磷轉運蛋白基因RT-PCR和Q-PCR引物序列

1.2.2 轉基因材料的處理方法 沙培試驗于2012年在河南農(nóng)業(yè)大學科教園區(qū)進行，人工氣候室內生長，基本條件：光強300 μmol/m2·s，光周期16 h；溫度25℃。煙草從種子消毒后在無菌水中黑暗催芽，露白后供給1/4營養(yǎng)液至四片真葉完全展開，然后進行營養(yǎng)處理。營養(yǎng)液的配方及濃度為［9]：2 mmol/L KNO3，1 mmol/L NH4NO3，1 mmol/L NaH2PO4，0.5 mmol/L Ca（NO3）2，0.25 mmol/L CaCl2，0.5 mmol/L MgSO4，20 μmol/L Fe-EDTA，9 μmol/L MnCl2，46 μmol/L H3BO3，8 μmol/L ZnSO4，3 μmol/L CuSO4，0.03 μmol/L（NH4）2MoO4，pH調至5.5左右。設置兩個磷水平（1 mmol/L和0.1 mmol/L），以磷酸二氫鉀為磷源，缺磷處理的營養(yǎng)液中要用等量的KCl補足K+的含量。2 d換一次營養(yǎng)液，每天調節(jié)pH為6.0。處理時間為3周。

1.2.3 生物量統(tǒng)計 常規(guī)方法，10個重復。

1.2.4 全磷含量和有效磷含量測定［8，10]采用鉬藍比色法。

1.2.5 基因表達分析［8，9]采用Trizol法提取煙草總RNA，樣品通過隨機引物法反轉錄合成cDNA。根據(jù)GenBank發(fā)布的水稻高親和磷轉運蛋白基因（Os-PT8）和煙草高親和磷酸鹽轉運蛋白基因（NtPT1和NtPT2）的序列設計各基因擴增引物，進行RT-PCR和Q-PCR。按照Invitrogen公司的RealMasterMix（SYBR Green）試劑盒說明書進行實時定量RT-PCR，每個樣品3次重復。實時定量的試驗數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt算法進行分析，假設目的基因在脅迫處理下的表達量是對照（正常培養(yǎng)）的N倍，N=2-ΔΔCt，ΔΔCt=Treat（Ct樣品-CtL25）- CK（Ct樣品-CtL25）。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用Sigmplot10.0和SPSS 12.0進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 OsPT8轉基因煙草的獲得及基因表達鑒定

將水稻中高親和磷轉運蛋白基因OsPT8插入到雙元表達載體Ubi-Ps1a-4，獲得Ubi -Ps1a-4∷OsPT8表達載體，利用農(nóng)桿菌介導法轉入煙草中。用OsPT8基因中特異的片段序列設計引物對轉基因煙株陽性苗進行檢測（數(shù)據(jù)未顯示），最后共得到OsPT8-Oe轉基因煙草陽性系株系15個，并獲得T0代種子。繼續(xù)對T1代轉基因株系進行檢測，最終選取其中兩個株系OsPT8-Oe1和OsPT8-Oe2（以下簡稱Oe1和Oe2）進行后續(xù)的生理試驗。對所選取兩個轉基因株系的OsPT8基因進行表達檢測，RT-PCR結果（圖1-A）顯示，OsPT8基因在兩個轉基因株系根部強烈表達，而野生型煙草中并未發(fā)現(xiàn)OsPT8基因的表達；為了確定檢測結果的準確性，同時采用Real-Time PCR（Q-PCR）的方法檢測了轉基因株系和野生型根部的OsPT8基因表達水平，結果（圖1-B）顯示，野生型煙草根部幾乎檢測不到OsPT8基因的表達，而轉基因株系中OsPT8基因卻強烈表達，兩個轉基因株系中該基因的表達量差異不顯著，這與RT-PCR結果一致。表明OsPT8基因已經(jīng)整合到煙草基因組中并在轉錄水平上表達。

2.2 過量表達OsPT8對煙草幼苗生物量的影響

圖1 OsPT8過量表達株系的獲得及檢測

為了分析高親和磷轉運蛋白OsPT8基因對煙草生長發(fā)育的影響，對正常供磷（1 mmol/L Pi）和低磷（0.1 mmol/L Pi）處理3周的煙株進行生物量統(tǒng)計。結果（圖2）顯示，在正常供磷條件下，兩個轉基因株系Oe1和Oe2的地下部生物量極顯著高于野生型，分別比野生型提高了39.13%和41.15%；地上部生物量相差不大，僅略高于野生型，差異不顯著（圖2-A）；兩個轉基因株系顯著增加了煙株的根冠比，分別比野生型提高了31.4%和32.6%（圖2-C），表明在正常供磷條件下過量表達OsPT8僅顯著增加了地下部的生物量，而對地上部生物量影響不顯著。低磷條件下轉基因煙株的地上部和地下部生物量均顯著高于野生型，達到了極顯著水平，其中兩個轉基因株系地下部和地上部與野生型相比分別提高了30.12%-31.55%和11.26%-12.11%（圖2-B）；由于兩個轉基因株系地上部和地下部生物量均顯著增加，因此轉基因株系根冠比略高于野生型（圖2-D）。這表明在低磷條件下過量表達OsPT8不僅顯著增加了轉基因煙草地下部的生物量，而對地上部的生物量也影響顯著。

2.3 過量表達OsPT8對煙草全磷和有效磷含量的影響

為了分析高親和磷轉運蛋白OsPT8基因對煙草植株中全磷和有效磷積累的影響，對正常供磷（1 mmol/L Pi）和低磷（0.1 mmol/L Pi）處理3周的煙株進行取樣，測定不同部位的全磷和有效磷含量。對全磷含量的分析發(fā)現(xiàn)，在正常供磷條件下，轉基因株系地上部和地下部全磷含量均極顯著高于野生型，其中地上部達到了野生型的1.61和1.69倍，而地下部也均比野生型提高了40%左右，兩個轉基因株系地上部全磷含量增加量均顯著高于地下部（圖3-A）；在低磷條件下，轉基因株系地上部和地下部全磷含量均顯著高于野生型（圖3-B），地上部和地下部均比野生型提高50%左右，兩個轉基因株系地上部和地下部全磷含量增加量差異不顯著。對有效磷含量的分析發(fā)現(xiàn)，在正常供磷和低磷條件下，轉基因株系地上部和地下部有效磷含量也均顯著高于野生型（圖3-C，3-D），兩個轉基因株系有效磷含量達到了野生型的2倍左右。轉基因株系和野生型植株全磷含量和有效磷含量分析結果基本一致，說明轉基因株系提高了煙株的有效磷利用，增強了煙草的耐低磷能力。

圖2 正常供磷（+P）和低磷（-P）條件下轉基因和野生型煙草生物量分析

2.4 過量表達OsPT8對煙草高親和磷轉運蛋白基因（Pht1）表達的影響

植物在磷營養(yǎng)脅迫時，高親和磷轉運蛋白會受缺磷誘導強烈表達，提高植物的磷吸收能力，以達到磷營養(yǎng)的最大程度優(yōu)化利用。目前，在煙草中共克隆出5個高親和磷轉運蛋白基因（Pht1;1-Pht1;5，以下簡稱NtPT1-NtPT5），其中NtPT1和NtPT2受缺磷誘導表達量顯著增強；我們分析了轉基因株系和野生型煙草這兩個基因的表達情況，結果（圖4）顯示，缺磷顯著上調了煙草高親和磷轉運蛋白（NtPT1和NtPT2）基因的表達，尤其是在根部。我們同時檢測了兩個轉基因株系Oe1和Oe2在正常供磷和低磷條件下根部NtPT1和NtPT2基因的表達情況。結果顯示，在正常供磷條件下煙株過量表達OsPT8基因可誘導NtPT1和NtPT2基因的表達。分析NtPT1基因的表達（圖4-A）發(fā)現(xiàn)，正常供磷條件下Oe1和Oe2轉基因株系NtPT1表達量分別是野生型的1.82倍和3.26倍，而低磷條件下轉基因株系表達量雖然顯著高于野生型，但是該基因增加量卻遠低于正常供磷的增加量。分析NtPT2基因的表達（圖4-B）發(fā)現(xiàn)，在正常供磷條件下未在野生型根系中檢測到該基因表達，而兩個轉基因株系中該基因強烈表達；在低磷條件下NtPT2基因表達量仍顯著高于野生型，均達到了野生型的2倍以上?；虮磉_分析表明，在煙草中過量表達OsPT8基因能改變煙草植株內高親和磷轉運蛋白家族成員的表達模式，可能與磷轉運蛋白家族成員之間的協(xié)同作用有關。

圖3 正常供磷（+P）和低磷（-P）條件下轉基因株系與野生型全磷和有效磷含量分析

圖4 正常供磷（+P）和低磷（-P）條件下轉基因株系和野生型根部高親和磷轉運蛋白的表達分析

3 討論

植物的生長離不開磷肥，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)肥料投入上畝施磷肥居高不下，植物對磷肥的吸收主要取決于植物根系，發(fā)掘植物中磷高效吸收的遺傳潛力是植物生物學家面臨的巨大任務［11]。鑒于此，本研究從水稻高親和磷轉運蛋白OsPT8功能出發(fā)，探索該基因在雙子葉模式植物模式煙草中耐低磷能力，對于豐富植物磷營養(yǎng)高效的分子機制，解決生產(chǎn)中大量磷肥浪費等現(xiàn)實問題具有重要意義。本研究表明OsPT8轉基因煙草在低磷脅迫下地上部和根系生物量顯著高于野生型，全磷含量和有效磷含量均比野生型提高50%以上，OsPT8基因過量表達提高了煙草的耐低磷能力。

植物體內磷缺乏時，蛋白質的合成受到阻礙，形成新的細胞質和細胞核較少，影響細胞正常分裂，導致生長比較緩慢，所以在形態(tài)結構表現(xiàn)出植株矮化，葉片變小，葉色暗綠或灰綠色，缺少光澤，分枝減少［12，13]。植物體內可以直接利用的磷素為有效磷［14，15]，植物缺磷時，首先表現(xiàn)在植株各個部位有效磷含量顯著改變，本研究結果表明在煙草中過量表達OsPT8基因顯著提高了煙草有效磷的含量。在正常供磷條件下，煙株長勢良好，磷酸鹽利用率較高，這與水稻中的結果不盡一致。在水稻中該基因過量表達雖然增加了磷酸鹽的利用率，但是造成了“磷中毒”現(xiàn)象，影響了水稻植株的正常發(fā)育，而在煙草中并未發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象，這可能是因為在水稻中OsPT8還參與磷信號與激素信號的互作，這還需要進一步的研究來證實。

植物Pht1家族基因同源性很高，所以各成員之間在功能上可能存在相互協(xié)作［8，16]。OsPT8作為水稻中一個關鍵的磷轉運蛋白，負責調控水稻體內磷素的動態(tài)平衡，影響水稻成熟期磷酸鹽從營養(yǎng)器官到生殖器官的轉運；在水稻中過量表達OsPT8基因同時可以引起其它Pht1家族成員的表達改變［8]。我們在煙草中的研究發(fā)現(xiàn)，在煙株中表達外源磷轉運蛋白基因OsPT8增強了煙草自身高親和磷轉運蛋白（NtPT1和NtPT2）基因的表達，這與在水稻中得到的基因協(xié)作結果相一致［8]，證明了磷酸鹽轉運蛋白之間存在協(xié)作。

4 結論

本試驗在煙草中驗證了OsPT8基因的功能，證明了該基因對于提高作物的磷酸鹽利用率具有重要作用，在煙草中過量表達該基因提高了煙草的耐低磷能力，為植物基因工程培養(yǎng)磷高效作物提供了理論依據(jù)。

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