香魚巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2基因的克隆、序列分析及表達(dá)

王世會(huì) 史雨紅 陳炯

（寧波大學(xué)應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧波 315211）

趨化因子（Chemokines，CK）是一類能使細(xì)胞發(fā)生趨化運(yùn)動(dòng)的小分子細(xì)胞因子，從1986年發(fā)現(xiàn)第一個(gè)趨化因子至今，至少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了60種趨化因子。其中趨化因子家族成員巨噬細(xì)胞炎性蛋白（Macrophage inflammatory protein，MIP）是由Wolpe等［1]于1988年首次發(fā)現(xiàn)的。脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7后，用肝素親和柱分離出了兩種新的蛋白質(zhì)MIP-1和MIP-2。這兩種蛋白質(zhì)分別占巨噬細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)的5%和2%［1，2]。通過這種方法他們所獲得的MIP-2是一分子量6 kD、成熟蛋白含有73個(gè)氨基酸殘基的堿性蛋白［3]。MIP-2具有重要的生理作用，可以特異性地趨化中性粒細(xì)胞到炎癥部位，從而消除炎癥反應(yīng)。Lentsch等［4]提到，小鼠由于局部出血而引起肝組織損傷中，MIP-2蛋白可以特異性地驅(qū)動(dòng)白細(xì)胞到達(dá)炎癥部位，消除炎癥反應(yīng)。同時(shí)在病毒性侵染導(dǎo)致的免疫應(yīng)答反應(yīng)中，病毒可以引起趨化因子MIP-2蛋白的表達(dá)量上調(diào)，影響免疫細(xì)胞殺傷病毒的能力，提高寄主對(duì)病毒的抗性［5]。小鼠在注射接種柯薩奇B3病毒（CVB3）14 d后，心肌組織MIP-2基因mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)［6]。除了具有趨化作用外，在造血調(diào)控中MIP-2也發(fā)揮著作用。Broxmeyer等［7，8]認(rèn)為MIP-2起到與其它造血因子協(xié)同或影響的作用。目前，關(guān)于MIP-2的文獻(xiàn)報(bào)道以人和鼠為主，而魚類MIP-2基因只能從數(shù)據(jù)庫中檢索到相關(guān)序列，暫無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

香魚（Plecoglossus altivelis，Sweetfish）隸屬胡瓜魚目香魚科，是東亞地區(qū)中國、日本和朝鮮等國家特有的一種小型經(jīng)濟(jì)名貴魚類［9]。近年來在中國的養(yǎng)殖面積日益增加，但病害問題嚴(yán)重。其中鰻利斯頓氏菌（Listonella anguillarum）是養(yǎng)殖香魚的主要病原菌之一，對(duì)香魚養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［10]。與直接使用化學(xué)試劑防治病害相比，免疫學(xué)方法對(duì)魚體和食用者更安全，對(duì)環(huán)境更環(huán)保。因此，本研究對(duì)香魚MIP-2基因進(jìn)行序列分析，分析其mRNA表達(dá)與鰻利斯頓氏菌感染相關(guān)性；采用原核表達(dá)獲得香魚MIP-2蛋白，制備香魚MIP-2抗血清，旨為進(jìn)一步深入研究香魚MIP-2蛋白功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康香魚購自寧海鳧溪香魚養(yǎng)殖場(chǎng)；ICR小鼠購自寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；鰻利斯頓氏菌香魚分離株sweetfish-H080701、大腸桿菌Top10和BL21 pLys E菌株、原核表達(dá)載體pGEX-3X等由本實(shí)驗(yàn)室提供；RNAiso試劑、SYBRPremix Ex Taq試劑盒、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶等購自TaKaRa公司；Gel Extraction Kit購自O(shè)mega公司；辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、顯影定影試劑盒、柯達(dá)X-OMAT BT膠片和壓片暗盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 購回的香魚在實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng)1周，隨機(jī)選取3尾健康香魚，采集心、肝、鰓、腎、腦、脾、肌肉、腸等組織，投入液氮中，隨后轉(zhuǎn)入超低溫冰箱中保存。剩余的香魚均分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每3尾一組，試驗(yàn)組每尾腹腔注射100 μL鰻利斯頓氏菌懸液（1.0×105CFU/mL PBS），對(duì)照組每尾注射100 μL PBS溶液。分別于注射后4、8、12和24 h取樣，取樣方法同上。

1.2.2 香魚MIP-2基因序列分析 利用巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得香魚MIP-2基因序列，采用PCR方法從香魚巨噬細(xì)胞cDNA中擴(kuò)增后測(cè)序驗(yàn)證，經(jīng)分析所獲得的序列與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致［11]。信號(hào)肽序列預(yù)測(cè)采用SignalP 4.0在線軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）。用MEGA 4.0軟件［12]進(jìn)行多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，所需基因序列信息，見表1。

表1 基因、物種、登錄號(hào)信息

1.2.3 香魚MIP-2基因mRNA的組織表達(dá)特征分析采用RNAiso試劑提取香魚總RNA，隨后用DNase I處理，再以oligo（dT）30為引物合成第一條cDNA鏈。根據(jù)MIP-2基因ORF序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物MIP-2-text-F（5'-CAGAGTCCTGATGCTCCTTGC-3'）和MIP-2-text-R（5'-CCAGTCTTATCTTGGGGTCGA-3'），預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長度為224 bp。以β-actin基因（AB020884）為內(nèi)參設(shè)計(jì)引物，pActin2（+）5'-TCGTGCGTGACATCAAGGAG-3'和pActin2（-）5'-CGCACTTCATGATGCTGTTG-3'，預(yù)期擴(kuò)增片段長度為231 bp。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測(cè)MIP-2基因mRNA在香魚各組織中的表達(dá)變化。

1.2.4 與鰻利斯頓氏菌侵染相關(guān)的香魚各組織MIP-2基因mRNA的表達(dá)變化 取腹腔注射后不同時(shí)間的香魚各組織，檢測(cè)MIP-2基因mRNA表達(dá)量的變化。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR來研究鰻利斯頓氏菌感染過程中香魚各組織MIP-2基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)變化情況。由程序MxPro 3.2讀取熒光定量結(jié)果，結(jié)果分析采用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法2-DDCt［13]，獲得香魚各組織MIP-2基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P<0.05為顯著差異。

1.2.5 香魚MIP-2基因的原核表達(dá)和抗血清制備 設(shè)計(jì)原核表達(dá)引物pGEX-3X-MIP-2（+）5'-CGCCATGACAACCAGAGTCCTGAT-3'和pGEX-3X-MIP-2（-）5'-GTCAGACTGTGTCTGGAA GCA-3'（下劃線限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I的識(shí)別序列），以香魚腎組織cDNA為模板，PCR擴(kuò)增MIP-2基因，預(yù)期大小產(chǎn)物（318 bp）經(jīng)2%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳分離后，切膠純化。純化產(chǎn)物經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序驗(yàn)證等步驟后，用BamH I和EcoR I雙酶切，回收的MIP-2片段插入到同樣雙酶切的pGEX-3X中，獲得重組質(zhì)粒pGEX-3X-MIP-2。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 pLys E后IPTG （終濃度0.4 mmol/L）誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測(cè)。預(yù)期大小的蛋白切膠純化后免疫小鼠，制備抗血清［9]。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡 12% SDS-PAGE分離膠中分離蛋白，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)PVDF膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用封閉液（含5%脫脂奶粉配制的PBST緩沖液），37℃封閉2 h。一抗（MIP-2小鼠抗血清）4℃孵育過夜，PVDF膜用PBST緩沖液清洗，每次10 min，共3次。隨后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，37℃孵育1 h。再用PBST清洗，每次10 min，共3次。加上ECL于暗室顯影。

2 結(jié)果

2.1 香魚MIP-2基因cDNA序列分析

MIP-2基因開放閱讀框的序列長度為318個(gè)核苷酸，編碼一個(gè)由105個(gè)氨基酸組成、相對(duì)分子質(zhì)量為11.6 kD的前體蛋白。用Signal P信號(hào)肽預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)前體蛋白N端19個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列，信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)是第19位的谷氨酰胺（Gln），成熟肽MIP-2預(yù)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量為9.4 kD。通過多重序列比對(duì)分析（圖1），可以看到CXC型趨化因子的典型結(jié)構(gòu)區(qū)域。

圖1 與MIP-2同源的氨基酸序列多重序列比對(duì)

氨基酸序列分析表明，香魚MIP-2與白斑狗魚（Esox lucius）MIP-2同源性最高，達(dá)54%。與其它魚類MIP-2的同源性介于39%-41%之間，與哺乳動(dòng)物MIP-2的同源性低于34%。系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）分析揭示，香魚的MIP-2和其它魚類中的MIP-2和IL8、IL-8like比較接近，而和哺乳動(dòng)物的相關(guān)基因則相差較遠(yuǎn)。

2.2 香魚MIP-2基因mRNA組織表達(dá)特征

圖3結(jié)果顯示MIP-2基因mRNA在各組織表達(dá)量有差異。健康香魚MIP-2基因mRNA在脾、腎、腦、鰓組織中表達(dá)量較高，在肝、心、肌肉和腸中表達(dá)量相對(duì)較少。

圖2 基于NJ法構(gòu)建的MIP-2蛋白氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖3 香魚MIP-2基因mRNA的組織表達(dá)特征

2.3 鰻利斯頓氏菌侵染后香魚各組織MIP-2基因mRNA的表達(dá)變化

鰻利斯頓氏菌感染香魚后，魚鰭基部出現(xiàn)充血發(fā)紅、 肌肉腐爛等典型的細(xì)菌敗血癥癥狀，而對(duì)照香魚未出現(xiàn)異常現(xiàn)象。由實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果可知，鰻利斯頓氏菌侵染香魚后，各組織中MIP-2基因mRNA出現(xiàn)不同程度表達(dá)上調(diào)。尤其是在腎組織和肌肉組織中上調(diào)最顯著，最高值分別為對(duì)照組的23和25倍。此后表達(dá)量上調(diào)趨緩，趨向恢復(fù)到對(duì)照組表達(dá)水平。而在心、鰓和肝組織中，8 h的表達(dá)量分別為對(duì)照組的15.5、13和11倍。其它組織脾、腦、腸中也都呈上調(diào)趨勢(shì)，最高值分別是對(duì)照組的5、4.3和6.8倍（圖4）。

2.4 香魚MIP-2基因的原核表達(dá)

重組質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證后，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BL21 pLys E中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，在12% SDS-PAGE分離膠中觀察到一條約為37 kD的融合蛋白條帶（圖5-A），與預(yù)測(cè)的MIP-2融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量吻合（37.3 kD）。該蛋白條帶切膠純化后免疫小鼠，制備抗血清。Western blotting檢測(cè)抗血清（圖5-B）。

3 討論

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，香魚MIP-2和白斑狗魚的MIP-2同源性最高，同時(shí)和其它魚類的IL-8、IL8-like也具有較高的同源性。由于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中，我們獲得了與IL8同源性更高的序列，因此，暫將該基因命名為MIP-2，其蛋白特性還需進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，鼠中的MIP-2和人類的IL8具有很高的同源性［14]，而鼠中的IL8一直未發(fā)現(xiàn)，所以有可能鼠中的MIP-2和人類中的IL8發(fā)揮著同樣的作用［15]。

本文研究表明，鰻利斯頓氏菌侵染后，香魚各組織中MIP-2基因mRNA表達(dá)量均出現(xiàn)顯著上調(diào)，說明MIP-2基因mRNA表達(dá)變化與鰻利斯頓氏菌侵染香魚的急性反應(yīng)相關(guān)。MIP-2基因mRNA與細(xì)菌感染相關(guān)性文獻(xiàn)主要集中對(duì)哺乳動(dòng)物小鼠和大鼠的研究，魚類暫無相關(guān)報(bào)道。大腸桿菌感染小鼠腎組織2 h時(shí)，MIP-2基因mRNA的表達(dá)上調(diào)29倍［16]。Rovai等［17]將LPS注射進(jìn)入小鼠體內(nèi)后，小鼠肺、心、肝、脾組織MIP-2基因表達(dá)均在感染后2 h出現(xiàn)顯著上調(diào)，隨后上調(diào)趨勢(shì)逐漸放緩。由b型流感嗜血桿菌所引起的小鼠腦膜炎病癥中，Diab等［18]發(fā)現(xiàn)MIP-2基因在感染12 h時(shí)上調(diào)表達(dá)，48 h達(dá)到峰值，7 d表達(dá)量趨近于正常水平。此外，關(guān)于MIP-2參與防御細(xì)菌感染的分子機(jī)制也有報(bào)道。在由克雷伯氏細(xì)菌引起的小鼠肺炎中，MIP-2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，同時(shí)可調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞抵達(dá)肺部清除病菌［19]。大鼠小腸感染病菌后，上皮細(xì)胞分泌MIP-2蛋白，調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞進(jìn)入到小腸以清除病菌［20]。通過對(duì)小鼠的研究發(fā)現(xiàn)MIP-2發(fā)揮免疫功能的機(jī)制是趨化中性粒細(xì)胞到炎癥部位，從而消除炎癥反應(yīng)。因此我們推測(cè)，香魚MIP-2蛋白可能也具有類似機(jī)制，但還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

原核表達(dá)作為最經(jīng)典、最成熟的蛋白表達(dá)系統(tǒng)被廣泛用于分子生物學(xué)和基因工程等研究。通過原核表達(dá)獲得目的蛋白，制備抗血清，進(jìn)而采用血清學(xué)方法檢測(cè)，為進(jìn)一步深入研究蛋白功能奠定了基礎(chǔ)［21]。因此，本研究通過原核表達(dá)獲得香魚MIP-2蛋白，制備香魚MIP-2抗血清，為研究MIP-2在香魚抗菌免疫中的作用奠定了基礎(chǔ)。

圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析鰻利斯頓氏菌侵染前后香魚各組織MIP-2基因mRNA表達(dá)變化

圖5 香魚MIP-2基因的原核表達(dá)的分析（A）SDS-PAGE和抗血清（B）的檢測(cè)

4 結(jié)論

從香魚巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中獲得香魚MIP-2基因。序列分析表明，香魚MIP-2具有已知的CXC型趨化因子特征性結(jié)構(gòu)，即含CXC的結(jié)構(gòu)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，香魚MIP-2和白斑狗魚的MIP-2同源性最高，同時(shí)和其它魚類的IL-8、IL8-like也具有較高的同源性。組織表達(dá)特征研究揭示，健康香魚MIP-2基因mRNA主要在脾、腎、腦、鰓組織中表達(dá)，在肝、心、肌肉、腸組織中表達(dá)次之。研究表明，被鰻利斯頓氏菌侵染后，香魚各組織中MIP-2基因mRNA表達(dá)量均出現(xiàn)顯著上調(diào)，說明MIP-2基因mRNA表達(dá)變化與鰻利斯頓氏菌侵染香魚的急性反應(yīng)相關(guān)。

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