沙亞哈提·別爾克哈之， 李 卉， 吉別克·瓦提別克， 劉伊寧， 李曉苗， 來雯婷，美麗吾爾提·達(dá)吾列提汗， 諶宏鳴， 李惠武

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 烏魯木齊 830011)

目前，越來越多的證據(jù)表明人乳頭狀癌病毒(Human papilloma virus，HPV)的感染與食管鱗癌的發(fā)生有關(guān)。Guo等[1]對安陽300例食管癌患者和900例正常人的食管組織進(jìn)行研究，結(jié)果表明HPV的感染與食管癌的發(fā)生關(guān)系非常密切，這為HPV感染是中國食管癌高發(fā)區(qū)病因提供了有力的證據(jù)，并且指出HPV16的感染與食管癌的關(guān)系最為密切。Lu等[2]將HPV16 E6E7蛋白融合疫苗注入HPV16 E7表達(dá)的食管鱗癌細(xì)胞株中，結(jié)果明顯降低了食管癌細(xì)胞的生長增殖。這一結(jié)果從另一方面證明HPV16 在食管癌的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。但尚無HPV E6/E7與凋亡調(diào)控因子關(guān)系的研究報道。

HPV16 是一類小型無胞膜的環(huán)狀雙鏈DNA病毒，具有高度的宿主特異性，其早期表達(dá)的2個蛋白E6和E7擾亂正常細(xì)胞周期活動和信號通路。Longworth等[3-4]報道，高風(fēng)險E7通過鋅指狀區(qū)域蛋白序列與組蛋白脫乙酰酶(HDACs)結(jié)合并直接調(diào)節(jié)病毒復(fù)制。作為促凋亡基因Bad 含有BH3結(jié)構(gòu)域的前凋亡蛋白，與Bcl-2抗凋亡蛋白形成二聚體，調(diào)控細(xì)胞凋亡。Bcl-2基因主要通過抑制后者發(fā)揮抗凋亡作用，是Bcl-2家族抗凋亡蛋白中的一員。本實驗通過用課題組前期構(gòu)建的 HPV16 E6 及E6E7 融合基因的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞 KYSE450細(xì)胞，過表達(dá)E6 及E6E7，檢測轉(zhuǎn)錄水平上Bcl-2和Bad 的表達(dá)變化，進(jìn)一步探討HPV16 E6/E7對凋亡調(diào)控因子Bcl-2和Bad表達(dá)的影響，以及凋亡調(diào)控因子與HPV的聯(lián)系。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞株和培養(yǎng)基食管癌細(xì)胞株KYSE450購自中國科學(xué)院細(xì)胞中心，小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，RPMI1640 培養(yǎng)基和胰蛋白酶購自美國GIBCO公司，DMSO(二甲基亞砜)購自SIGMA公司，HDAC Inhibitor購自美國SIGMA公司。

1.2細(xì)胞的培養(yǎng)食管癌細(xì)胞株KYSE450使用RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清及青霉素、鏈霉素和兩性霉素各 100 U/mL)，置 37℃、飽和濕度、5%CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天觀察。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞KYSE450：實驗共分正常培養(yǎng)組(C)、空載體pLVX-AcGFP1-N1轉(zhuǎn)染組(P)、空載體pLVX-AcGFP1-N1轉(zhuǎn)染抑制組(iP)、pLVX-AcGFP1-N1-E6轉(zhuǎn)染組(iE6)及pLVX-AcGFP1-N1-E6E7融合基因轉(zhuǎn)染組(E6E7)5組。12孔板內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞至80%融合度時,用低血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞,以 4 μL LipofectamineT M 2000轉(zhuǎn)染 1.6 μg質(zhì)粒 DNA, 6 h后更換含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基,同時對于轉(zhuǎn)染組用2 nm/L的TSA的培養(yǎng)液培養(yǎng)，孵箱內(nèi)繼續(xù)孵育48 h。

1.3試劑和儀器Trizol、異丙醇、溴化乙錠(Sigma公司),M-MLV cDNA合成試劑盒(Promega公司),PCR均用試劑盒、DNA Marker、6×Loading buffer、瓊脂糖、50×TAE(上海生工生物技術(shù)有限公司)，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

opti-MEM?I 低血清培養(yǎng)基(美國 Invitrogen公司),低溫高速離心機(jī)(Beckman CoulterTM，美國),梯度PCR儀( iCyclerTM Thermal Cycler，美國),凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)，生物安全柜(HERA safe，德國)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海華達(dá)器材廠)。

1.4RT-PCR檢測及結(jié)果判定

1.4.1 總RNA提取 按Trizol一步法提取RNA，紫外分光光度計測定各組RNA濃度和A260/280比值，RNA保存于-80℃。

1.4.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù)Genebank查找 Bad與Bcl-2序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計其引物，引物序列如下：Bad上游引物：5′-CAGAGTTTGAGCCGAGTGAGC-3′，下游引物：5′-CCCATCCCTTCGTCGTCCT-3′，片段長度為247 bp。Bcl-2 上游引物：5′-CGCTGGGAGAACAGGGTA-3，下游引物：5′-GGGCTGGGAGGAGAAGAT-3′，片段長度為151 bp。GAPDH 上游引物：5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′，下游引物：5′-AAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′，片段長度為309 bp。

1.4.3 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 總RNA 1 μL、oligo(dT)引物1 μL、RNase-free Water 9 μL混勻后置于72℃ 10 min，取出后置于冰上逐次加入MgCl24 μL、dNTP 2 μL、10倍反應(yīng)緩沖液2 μL、RNA酶抑制劑0.5 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，最終體積達(dá)到20 μL。混勻后置于42℃ 1 h，用95℃ 5 min終止反應(yīng)。取出后置冰上，加80 μL雙蒸水，得到100 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng) 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA模板2 μL，待擴(kuò)增的各基因上下引物各1 μL，即用PCR反應(yīng)試劑盒反應(yīng)溶液10 μL，ddH2O 6 μL，總體積20 μL。

1.4.5 RT-PCR反應(yīng)條件 用cDNA為模板，以GAPDH作為內(nèi)參對照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系20 μL：上下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，模板 cDNA 2.0 μL，ddH2O 6.0 μL，Mg2+0.4 μL，退火溫度60℃，35個循環(huán)。

目的基因的擴(kuò)增: 取2×Taq PCR Master Mix 10 μL，向其中加入目的基因正向和反向引物各1 μL、6 μL ddH2O，再加入2 μL的 cDNA模板，最終的PCR反應(yīng)體系為20 μL，Bcl-2與Bad 的退火溫度分別為58℃和60℃。

1.4.6 PCR產(chǎn)物凝膠電泳 10 μL產(chǎn)物加入1 μL 5×Loading Buffer上樣緩沖液，經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外光凝膠成像分析儀下分析結(jié)果，用內(nèi)參照光密度值標(biāo)化Bad、Bcl-2的吸光度值，得到目的基因表達(dá)的相對含量。

2 結(jié)果

2.1Bad和Bcl-2基因的表達(dá)Bad mRNA在食管癌細(xì)胞KYSE450中表達(dá)較低，E6E7過表達(dá)對細(xì)胞內(nèi)Bad 基因 mRNA水平無影響，各轉(zhuǎn)染組之間無差異。Bcl-2 mRNA 在正常組(C)和空載體組(P)中均有表達(dá)，E6E7融合基因轉(zhuǎn)染組(E6E7)的表達(dá)量高于其他各組，E6/E7對Bcl-2有輕度上調(diào)作用(表1)。

2.2HDAC抑制劑(TSA)對E6調(diào)控Bcl-2基因表達(dá)的影響經(jīng)過HDAC抑制劑TSA處理后，盡管Bcl-2基因的表達(dá)水平受到了抑制，但TSA卻明顯增加了E6對Bcl-2基因表達(dá)的誘導(dǎo)調(diào)控作用(表1、圖1)。

圖1 轉(zhuǎn)染KYSE450細(xì)胞后目的基因的檢測

組別Bcl-2Bad正常組(C)0.244±0.2040.093±0.041空載體組(P)0.167±0.0240.002±0.003空載體抑制組(iP)0.052±0.0380.014±0.009E6E7組(E6E7)0.042±0.0310.007±0.003E6抑制組(iE6)0.004±0.0010.050±0.033

3 討論

腫瘤的發(fā)生是一個復(fù)雜的過程，伴隨多種可能的機(jī)制。HPV16早期表達(dá)基因可能參與細(xì)胞周期的腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程，但對于E6/E7是否對腫瘤細(xì)胞凋亡過程進(jìn)行調(diào)控尚未見報道。HPVs 是一類小型無胞膜的環(huán)狀雙鏈DNA病毒，具有高度的宿主特異性,并對鱗狀上皮細(xì)胞極具感染力[5-6]。最近的研究發(fā)現(xiàn)抑制HPV E6和E7致癌基因可引起細(xì)胞凋亡，并激活腫瘤細(xì)胞抑制通路[7]。Bad蛋白可能通過與凋亡抑制基因Bcl-2和Bcl-xl等的表達(dá)產(chǎn)物形成異源二聚體而達(dá)到促凋亡效果[8-9]。Bcl-2基因是Bcl-2基因家族的一個重要成員， Bcl-2可以通過阻止caspase的活化在線粒體細(xì)胞色素C釋放的上游發(fā)揮其抗凋亡的作用[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2在腎臟腫瘤、胃腸腫瘤中高表達(dá)，細(xì)胞凋亡受到抑制，加速腫瘤生長，預(yù)后差[12-13]。Schimmer等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在Bcl-2基因和Bcl-xl基因過表達(dá)的情況下，Bad蛋白可直接誘導(dǎo)凋亡，具有治療意義。Hattori等[15]認(rèn)為，促凋亡的Bad蛋白與抗凋亡的Bcl-2蛋白競爭性結(jié)合形成異二聚體調(diào)節(jié)凋亡過程。

HDAC抑制劑是一類新型抗腫瘤藥物，其通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)而調(diào)控基因表達(dá)。HDAC抑制劑的主要生物效應(yīng)包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡、增強化療和放療敏感性、逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移性腫瘤的惡性表型等抗腫瘤效應(yīng)[16-17]。本實驗對食管癌KYSE450細(xì)胞中Bad mRNA水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示Bad mRNA水平在 E6 載體轉(zhuǎn)染組、E6E7 融合基因載體轉(zhuǎn)染組、正常培養(yǎng)組和空載體組間沒有明顯變化。推測該食管癌細(xì)胞中，E6、E7 與Bad之間在轉(zhuǎn)錄水平上可能不存在調(diào)控關(guān)系，Bcl-2 mRNA 在正常培養(yǎng)組和空載體轉(zhuǎn)染組中均有表達(dá)， E6E7融合基因轉(zhuǎn)染組的表達(dá)量高于其他各組，說明E6/E7對Bcl-2有輕度調(diào)控作用，使該基因表達(dá)增高, 這與目前研究報道一致，本研究中，E6/E7的表達(dá)促進(jìn)Bcl-2 在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步驗證。 HDAC抑制劑 TSA處理后，盡管Bcl-2基因的表達(dá)受到了抑制，但TSA卻明顯增加了E6對Bcl-2基因表達(dá)的誘導(dǎo)調(diào)控作用，提示HDAC在細(xì)胞中E6與Bcl-2在轉(zhuǎn)錄水平上存在調(diào)控關(guān)系。

綜上所述，病毒感染后早期表達(dá)致癌基因 E6、E7 可能刺激腫瘤轉(zhuǎn)移因子 Bcl-2 在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)，促進(jìn)了腫瘤的惡性發(fā)展。Bcl-2作為主要的調(diào)亡調(diào)控因子，在腫瘤的生物學(xué)行為中起著重要的作用。進(jìn)一步研究E6、E7調(diào)控Bcl-2在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制，對腫瘤早期診斷和臨床治療具有有意義的價值。

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