聶聰科, 劉江彬, 王 皓， 譚 凡， 王云玲

(1新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院影像中心， 2新疆兵團第七師醫(yī)院， 烏魯木齊 830063)

研究表明，肝纖維化經積極有效的治療，可發(fā)生逆轉[1]，因此對肝纖維化進行血生化檢查、影像學檢查以及一些實驗室檢查等一直是研究的熱點。近些年來，雙源CT相對于傳統(tǒng)多層螺旋 CT的優(yōu)勢在于采用短時間間隔、大螺距、往復掃描模式實現了全肝灌注[2]，為彌漫性肝病血流動力學的評估提供了可靠的硬件及軟件基礎。本研究將雙源CT灌注成像應用于兔肝纖維化模型，以病理結果為標準,檢測不同分期肝纖維化肝灌注參數以及血清學指標，探討雙源CT灌注參數值聯(lián)合血清學指標在診斷肝纖維化分期的應用價值。

1 材料與方法

1.1實驗動物與試劑本研究通過倫理委員會審核通過。健康新西蘭大白兔70只，雌雄不限，體質量約2.5～4.5 kg，平均(3.4±1.1)kg，由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供。隨機分成兩組，實驗組60只，對照組10只。四氯化碳(CCl4天津永晟精細化工有限公司)，橄欖油(托雷斯和利貝雷斯公司),透明質酸(hyaluronic acid, HA)，層黏連蛋白(laminin, LN), Ⅲ型前膠原(type Ⅲ procollagen, PC Ⅲ)及Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)試劑盒購自北京科美東雅生物技術公司。DFM-96全自動γ計數儀(合肥眾成公司)。

1.2動物模型與血清制備實驗組經腹腔注射10%CCl4橄欖油溶液，對照組注射生理鹽水，0.1 mL/kg，1 w2次，共24 w，均給予常規(guī)動物飲食，每隔4 w行雙源CT灌注掃描。實驗前禁食水8 h左右，去除耳朵及腹部體毛，經耳緣靜脈留置套管針，采血5 mL，4 000 r/min離心10 min，靜置留取血清，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。給予3%戊巴比妥鈉進行麻醉。待瞳孔反射變淺、肌張力明顯下降時，將兔子以俯臥位固定于掃描床，給予腹部加壓帶包扎控制呼吸，然后進行掃描。掃描結束后6 h，耳源靜脈給藥至深度麻醉，開腹取肝臟進行病理檢查。

1.3CT灌注掃描采用雙源CT(Somatom Definition Flash,Forcheim,Germany)及雙筒高壓注射器，按2 mL/kg的比率、0.4 mL/s的流率團注碘普羅胺(370 mg/mL)，以同樣流率追加等量生理鹽水。采用新雙源全肝灌注模式掃描，掃描30個動態(tài)，每個動態(tài)1.5 s，共45 s。管電壓80 kV，管電流70 mAs，準直寬度分別為32 mm、1.2 mm，層厚3 mm。

1.4肝纖維化病理學分期取材層面應盡量與圖像上的ROI選取層面相一致，分別行HE及Masson染色，然后進行分期。肝纖維化分期標準參照2002年肝纖維化診斷評估標準[3]：0期：無纖維化；1期：匯管區(qū)纖維化擴大，局限于竇周和小葉內纖維化；2期：匯管區(qū)周圍纖維化，纖維間隔形成，小葉結構保留；3期：纖維間隔伴小葉結構紊亂，無肝硬化；4期：早期肝硬化。

1.5血清學指標檢測由-80℃冰箱取出，按照北京科美東雅生物技術公司所提供試劑盒操作步驟，均采用放射免疫法，檢測HA、PCⅢ、Ⅳ-C和LN值。采用DFM-96全自動γ計數，進行統(tǒng)計學分析。

2 結果

2.1造模情況實驗組兔60只，死亡14只，死亡率為23.3%。死亡原因有肝損傷、腹腔出血、腹瀉等。造模兔符合灌注軟件分析要求的共40只。對照組兔10只全部存活并完成檢查。

2.2病理檢測結果實驗組兔肝臟質地不均，表面呈不小不等顆粒狀改變；HE染色可見纖維間隔包繞正常肝組織形成假小葉(圖1 a)；Masson染色可見藍色膠原纖維沉積(圖1 b)。病理分期：1期為11只，2期為12只，3期為9只，4期為8只。對照組：肝臟表面光滑，正常肝小葉結構存在，肝細胞排列整齊，全部納入0期。

2.3灌注及血清學檢查結果將所得灌注圖像傳送至Syngo Volume perfusion CT體部灌注軟件進行分析，通過軟件后處理生成相對應的時間密度曲線(圖2)，然后通過色階賦值生成相應的灌注偽彩圖。避開大血管及膽道，分別在肝左葉、右葉圖像上共選取6個感興趣區(qū)，計算獲得ALP、PVP、HPI、BF、BV的平均值(圖3)。

隨著肝纖維化分期的增加，PVP值呈下降趨勢(P<0.05)，HPI值呈上升趨勢(P<0.05)，ALP先輕度下降后然后上升(P>0.05)(表1)。PVP S2、S3、S4分別低于S0、S1期，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。PVP與肝纖維化的嚴重程度呈負相關(r=-0.84,P=0.013)，HPI與肝纖維化的嚴重程度呈正相關(r=0.62，P=0.021)。BF、BV、ALP與肝纖維化嚴重程度無相關性(P值均>0.05)。HA、PCⅢ、IV-C和LN均逐漸增隨著肝纖維化程度加重而升高(表2)，血清學指標HA、IV-C與肝纖維化程度關系較為密切(r=0.75，P<0.05；r=0.62，P<0.05)。

a: HE染色顯示大量纖維包繞形成假小葉(HE×100)

b: Masson染色顯示大量纖維包繞形成假小葉(Masson×100)

圖1實驗組病理結果

圖2后處理圖像生成動脈(紅色)、外部組織(黃色)時間密度曲線

表1 不同肝纖維化分期的肝灌注參數比較

注：與S0比較，*P<0.05；與S1比較，△P<0.05。

表2 不同肝纖維化分期的血清學指標比較(μg/L, ±s)

注：與S0比較，*P<0.05；與S1比較，△P<0.05。

圖3 多平面重建選取感興趣區(qū)并得到相應灌注值

3 討論

目前，診斷肝纖維化的金標準為肝穿刺活檢，其為有創(chuàng)檢查，不便動態(tài)的隨訪及復查，不易為患者所接受[4]。部分學者主要集中在探討影像學或血清學指標在早期診斷肝纖維化中的應用，如何能夠將二者充分利用其優(yōu)勢來互補，是研究中熱點。肝纖維化是當炎癥刺激或者其他因素導致細胞水腫、壞死時，細胞外基質異常增多或者過度沉積的一個可逆轉的病理過程，主要表現為肝內纖維結締組織增生。其隨著病程加重可進展為肝硬化。隨著病程的演變，病理改變主要表現為細胞水腫進而壞死、廣泛纖維間隔形成以及肝細胞結節(jié)樣增生。這些病理變化在早期通過形態(tài)學往往難以發(fā)現，但有研究表明，肝小葉結構的血液循環(huán)途徑已經逐步發(fā)生變化。因此，通過CT灌注尋找出早期能夠反映血流動力學變化的特征性指標是值得探討的。

常規(guī)螺旋CT灌注成像在注入對比劑的同時對選定的層面進行連續(xù)掃描，以獲取該層面內每一像素的密度隨時間變化的曲線，并通過不同的數學模型計算出血流灌注參數，從而對組織的血流動力學的變化做出評價。由于受限于探測器的寬度，只能局限于對選定的層面進行評估。而雙源CT的4D掃描覆蓋范圍達48 cm，實現了全臟器容積灌注。通過調整采集時間窗，4D螺旋技術可以減低輻射劑量，同時可以獲得最好的時間分辨率。本研究采用的數學模型是適于對器官組織進行灌注測量的最大斜率法，其優(yōu)點是不需要靜脈時間密度曲線的計算，掃描時間相對短，檢查流程快。同時后處理軟件可實現系統(tǒng)運動偽影校正，同時應用4D降噪技術保證圖像擁有更好的信噪比，能夠更直觀對圖像進行分析以便能夠更準確地反映血流動力學的變化。

本實驗結果顯示PVP隨著肝纖維化嚴重程度的升高，呈現出下降趨勢，且差異具有統(tǒng)計學意義?？紤]是由于微循環(huán)及結構因素的共同影響,早期微循環(huán)發(fā)生障礙導致肝細胞缺血腫脹壓迫門脈，導致門脈灌注量下降[5]。隨著小葉纖維間隔出現(S1期)逐漸加重至最終假小葉形成(S4期)，肝內微循環(huán)發(fā)生顯著的變化，加之門脈血管扭曲、變形，血流灌注阻力明顯加大，進而明顯減少肝內血管床面積。從組織學方面來說，門脈相對于肝動脈來說，管壁平滑肌纖薄，因此受擠壓影響相對較重[6]。這些因素共同作用均導致門脈灌注下降，且隨著疾病嚴重程度加重表現的更為明顯。從S0到S4期，ALP表現為先減低后逐漸升高，這與章雅琴等[7]的研究結果存在著差異，但各組間差異無統(tǒng)計學意義?？紤]早期ALP減低是由于局部血流微循環(huán)成分發(fā)生改變，血液粘度增加，血供減弱，引起肝細胞缺血、壞死，繼而刺激肝間質纖維增生，壓迫肝血竇導致肝動脈灌注減低。后期灌注量升高考慮是由于PVP持續(xù)下降，為了維持總肝灌注量，肝臟發(fā)揮內源性調控作用，所以肝動脈灌注量呈現出上升趨勢，即便在統(tǒng)計學上各組間無明顯差異。而HPI 之所以逐級升高, 尤其是在后期肝動脈的血流灌注量權重比增大時, 這與肝臟自身調節(jié)功能是存在關系的，因此在評價HPI時, 要考慮到 HPI是一個相對值, 受門脈及動脈供血的雙重影響[8]。另外，本研究中BF、BV與肝纖維化分期無相關性，與一些學者所報道的BF、BV隨著肝纖維化的嚴重程度加重而減小的結果不一致[9-10]，推測其原因可能是全肝各段灌注情況存在差異,本研究實行的是全肝灌注掃描相比選定的層面進行掃描所得到的數據更為準確。

血清學指標HA、PCⅢ、IV-C和LN隨著肝纖維化的加重，表現為逐步升高，且以HA、IV-C與肝纖維化程度相關性為著。纖維化時，細胞外基質明顯增加，而血清學指標均屬于細胞外基質成分，因此血清學指標能夠充分地反映肝纖維化程度。HA 提示肝竇毛細血管化，主要反映內皮細胞功能。本研究發(fā)現HA在S0、S1、S2期與S3、S4期中差異有統(tǒng)計學意義，與文獻報道的一致，對重度肝纖維化有較大的價值。IV-C與持續(xù)沉積的LN是基底膜的主要成分，導致肝竇毛細血管化。有研究表明，LN與門靜脈高壓程度呈正相關[11]。本研究中IV-C除了S0、S1期差異無統(tǒng)計學意義外，其余各期都有差異，表明IV-C能夠很好地反映肝纖維化的活動進程。

總之,雙源灌注成像可以得到反映肝纖維化血流灌注情況的定量參數，從血管微循環(huán)的水平評估組織代謝情況，是一種非侵入性的評價方法，安全、可靠，將肝灌注的血流動力學指標與血清學的指標相結合，對臨床診斷肝纖維化、動態(tài)隨訪及監(jiān)測預后有著良好的應用前景。

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