王智明

·實(shí)驗(yàn)研究·

地爾硫卓對(duì)心臟缺血再灌注后心肌炎癥的影響研究

王智明

目的探討地爾硫卓對(duì)心臟缺血再灌注后心肌炎癥的影響。方法首先建立大鼠心臟缺血再灌注模型, 將存活大鼠隨機(jī)分為缺血再灌注組(I/R組)和地爾硫卓組(D組), 另設(shè)假手術(shù)組(S組)作為對(duì)照。分別在術(shù)后1周、2周、4周三個(gè)時(shí)間點(diǎn), 對(duì)各組大鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)、心肌炎癥細(xì)胞檢測(cè)以及多種細(xì)胞炎癥因子檢測(cè)。結(jié)果術(shù)后第4周超聲心動(dòng)圖檢測(cè), I/R組與S組和D組比較, 左心室射血分?jǐn)?shù)(EF)和左心室短軸縮短率(FS)均有明顯下降, 但左心室重量(LVM)卻明顯增加, P＜0.05, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 心臟功能受到嚴(yán)重影響；I/R組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況明顯嚴(yán)重于S組和D組；I/R組致炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α在缺血再灌注之后有明顯高表達(dá), 抗炎因子IL-10和TGF-β1表達(dá)水平較低。結(jié)論心臟出現(xiàn)缺血再灌注之后, 地爾硫卓可以有效抑制炎癥細(xì)胞的活化和炎癥因子的分泌, 能夠有效減輕心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng), 較好的改善心臟功能, 為地爾硫卓臨床治療心臟缺血再灌注后心肌炎癥提供了理論基礎(chǔ)。

地爾硫卓；心臟缺血再灌注；心肌炎癥

心臟缺血再灌注是冠狀動(dòng)脈再通后的主要并發(fā)癥, 極易引發(fā)患者心肌損傷, 甚至造成死亡。研究表明, 心臟缺血再灌注導(dǎo)致的心肌炎癥與心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度有密切關(guān)系,而地爾硫卓(Diltiazem)作為鈣離子通道阻滯劑, 能夠起到保護(hù)心肌細(xì)胞、避免心肌炎癥的作用, 主要機(jī)制可能與其抑制心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度有關(guān)［1］。本文通過(guò)研究大鼠心臟缺血再灌注模型中淋巴細(xì)胞表達(dá)的各種炎癥因子含量以及使用地爾硫卓干預(yù)之后各種炎癥因子含量發(fā)生的變化以及心肌炎癥反應(yīng)的變化, 來(lái)探討地爾硫卓對(duì)心臟缺血再灌注后心肌炎癥的影響, 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1大鼠心臟缺血再灌注模型的建立與實(shí)驗(yàn)分組 選擇實(shí)驗(yàn)大鼠：雄性, 體重200～250 g, 均符合Sprague-Dawley清潔級(jí)。模型建立前記錄大鼠的體重, 然后用戊巴比妥鈉進(jìn)行注射麻醉, 使用小動(dòng)物呼吸機(jī)通過(guò)氣管插管輔助呼吸, 操作過(guò)程中時(shí)刻監(jiān)視心電圖的變化。在左側(cè)胸腔處實(shí)行開胸, 并打開心包, 在左心右下緣1 mm附近, 使用無(wú)損傷縫針穿過(guò)左冠狀動(dòng)脈的心肌表層, 進(jìn)行結(jié)扎, 30 min后恢復(fù)血流, 最后逐層縫合胸腔。大鼠恢復(fù)自主呼吸后去掉呼吸機(jī), 保溫待其清醒。假手術(shù)組同樣經(jīng)歷以上手術(shù)過(guò)程, 但不進(jìn)行結(jié)扎。選擇術(shù)后存活大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn), 所有大鼠均在相同條件下飼養(yǎng)。

大鼠分組：①D組：術(shù)后用地爾硫卓干預(yù)組30只, 選擇1周、2周、4周三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別注射和口服地爾硫卓,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)10只；②I/R組：心臟缺血再灌注組30只, 在相同時(shí)間點(diǎn)注射和口服生理鹽水作為對(duì)照；③S組：假手術(shù)組30只, 同樣時(shí)間注射和口服生理鹽水。

1.2地爾硫卓藥物用量 參照中國(guó)《不穩(wěn)定心絞痛治療建議》中推薦的成人用量30～60 mg t.i.d./q.i.d., 同時(shí)參考國(guó)外試驗(yàn)用量360 mg/d［2］。本實(shí)驗(yàn)制定的D組大鼠用藥量為：每天36 mg/200 g, 進(jìn)行冠狀動(dòng)脈結(jié)扎手術(shù)后對(duì)大鼠進(jìn)行尾靜脈注射地爾硫卓4.5 mg/4.5 ml, 輸液泵維持3 h, 后該改為灌胃36 mg/4 ml·200g(36 mg地爾硫卓+4 ml生理鹽水), 給藥1次/d直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.3超聲心動(dòng)圖檢測(cè) 在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處, 1周、2周、4周三個(gè)時(shí)間點(diǎn), 進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。先用適量戊巴比妥鈉對(duì)大鼠進(jìn)行注射麻醉, 用二維圖像引導(dǎo)做出M型曲線, 并測(cè)量。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)選取5個(gè)心動(dòng)周期, 分別記錄各項(xiàng)指標(biāo)值并計(jì)算平均值作為該指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄, 同時(shí)進(jìn)行圖像錄像。

超聲檢測(cè)指標(biāo)包括：心率(HR)；左心室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)和收縮末期內(nèi)徑(LVDs)；左心室舒張末期前壁厚度(AWT)和后壁厚度(PWT)；左心室舒張末期容積(LVEDV)和收縮末期容積(LVESV), 計(jì)算公式：V=1.04×D3, 其中D為內(nèi)徑；左心室重量(LVM)=［1.05×(LVDd+AWT+PWT)］3-LVDd3；左心室短軸縮短率(%FS)= (LVDd-LVDs)/LVDd×100%；每心搏量(SV)= LVEDV-LVESV；左心室射血分?jǐn)?shù)(%EF)=SV/ LVEDV×100%。

1.4心肌炎癥細(xì)胞檢測(cè) 在每個(gè)時(shí)間點(diǎn), 提取各組大鼠心肌組織制作石蠟切片, 并用HE染色, 統(tǒng)計(jì)各種炎癥細(xì)胞的數(shù)量并記錄。

1.5大鼠心肌細(xì)胞炎癥因子檢測(cè) 在每個(gè)時(shí)間點(diǎn), 提取各組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞炎癥因子RNA, 然后逆轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行PCR反應(yīng), 檢測(cè)各種細(xì)胞因此的含量。細(xì)胞炎癥因子主要包括致炎因子：IL-1β(Interleukin 1β, 白介素-1β)、IL-6(白介素-6)、TNF-α(Tumor necrosis factorα, 腫瘤壞死因子-α),以及抗炎因子：IL-10(白介素-10)、TGF-β1(Transforming growth factor-β1, 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 采用χ2檢驗(yàn), 當(dāng)P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠超聲心動(dòng)圖變化情況 術(shù)后1周和2周, 各組大鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)并沒有顯著性差異；術(shù)后第4周超聲心動(dòng)圖檢測(cè), I/R組與S組和D組比較, 左心室射血分?jǐn)?shù)(EF)和左心室短軸縮短率(FS)均有明顯下降, P＜0.05, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；左心室重量(LVM)I/R組也明顯高于S組和D組, P＜0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 證明I/R組心室增厚嚴(yán)重。詳見表1。

表1各組大鼠超聲心動(dòng)圖變化情況

表1各組大鼠超聲心動(dòng)圖變化情況

注：P值為I/R組分別與S組和D組相比較的差異系數(shù)

組別HR(bpm)LVM(g)LVEDV(ml)LVESE(ml)SV(ml)EF(%)FS(%) S 462±340.68±0.120.19±0.030.03±0.020.15±0.0388.3±2.956.7±3.7 I/R401±290.92±0.110.20±0.040.06±0.030.14±0.0259.6±3.126.7±2.1 D 359±310.81±0.120.18±0.050.05±0.020.13±0.0273.7±2.937.4±2.6 P值＜0.05＜0.05＜0.05

2.2各組大鼠術(shù)后第4周時(shí)心肌炎癥細(xì)胞變化情況 術(shù)后第4周時(shí), 光鏡下觀察各組大鼠心肌組織切片并統(tǒng)計(jì)各種心肌炎癥細(xì)胞的數(shù)目。S組心肌炎癥細(xì)胞很少；I/R組炎癥明顯, 中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯；D組經(jīng)過(guò)地爾硫卓治療, 心肌炎癥細(xì)胞明顯減少；統(tǒng)計(jì)分析I/R組與S組和D組相比較炎癥細(xì)胞明顯較多, P＜0.05, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見表2。

表2各組大鼠術(shù)后第4周時(shí)心肌炎癥細(xì)胞變化情況n=10)

表2各組大鼠術(shù)后第4周時(shí)心肌炎癥細(xì)胞變化情況n=10)

注：P值為I/R組分別與S組和D組相比較的差異系數(shù)

組別中性粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞淋巴細(xì)胞S 10±68±55±2 I/R108±14103±1146±5 D 51±1248±1321±4 P值P＜0.05P＜0.05P＜0.05

2.3各組大鼠術(shù)后心肌細(xì)胞炎癥因子表達(dá)情況 結(jié)果顯示致炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α在缺血再灌注之后有明顯的提高, 術(shù)后1～2周達(dá)到峰值, 在第4周稍微降低, 但含量仍較高, 使用地爾硫卓進(jìn)行治療之后, 致炎因子表達(dá)明顯降低, P＜0.05, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。I/R組與D組抗炎因子IL-10和TGF-β1表達(dá)水平相近, 都沒有高水平表達(dá), 因此I/R組表現(xiàn)出的炎癥反應(yīng)明顯強(qiáng)于D組。詳見表3。

表3各組大鼠術(shù)后心肌細(xì)胞炎癥因子變化情況n=10)

表3各組大鼠術(shù)后心肌細(xì)胞炎癥因子變化情況n=10)

組別第1周第2周第4周IL-1βS0.211±0.0060.124±0.0040.113±0.017 I/R1.658±0.0211.621±0.0251.562±0.034 D0.564±0.0080.634±0.0150.572±0.024 IL-6S0.213±0.0080.212±0.0070.211±0.005 I/R1.102±0.0130.924±0.0150.756±0.014 D0.534±0.0070.512±0.0040.498±0.006 TNF-αS0.224±0.0020.153±0.0070.132±0.004 I/R1.652±0.0141.317±0.0171.134±0.012 D0.762±0.0130.634±0.0110.542±0.012 IL-10S0.143±0.0070.086±0.0040.032±0.001 I/R0.624±0.0140.586±0.0160.241±0.027 D0.543±0.0120.521±0.0110.086±0.007 TGF-β1S0.204±0.0030.156±0.0140.127±0.004 I/R0.678±0.0160.627±0.0130.586±0.006 D0.624±0.0210.581±0.0240.241±0.007

3 討論

心臟缺血再灌注引起心肌損傷主要是指心臟在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)供血中斷后再恢復(fù)供血, 使心肌出現(xiàn)損傷, 且心肌損傷與胞內(nèi)鈣離子濃度升高有密切關(guān)系。心臟缺血再灌注后鈣離子濃度升高可引起心肌炎癥等心肌損傷的主要機(jī)制有以下幾個(gè)方面：Ca2+濃度升高激活Ca2+依賴性蛋白酶、Ca2+依賴性核酸內(nèi)切酶以及Ca2+依賴性磷脂酶, 從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用, 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞細(xì)胞凋亡［3］；心臟缺血再灌注引起內(nèi)皮細(xì)胞Ca2+濃度升高, 直接對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞造成損傷, 還可以增加內(nèi)皮細(xì)胞中粘附因子的表達(dá), 促進(jìn)血小板和炎癥細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附, 誘導(dǎo)心肌出現(xiàn)炎癥反應(yīng)［4］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 大鼠心臟缺血再灌注后心肌細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的死亡, 在第4周時(shí)心臟出現(xiàn)嚴(yán)重的功能性障礙, 應(yīng)用地爾硫卓進(jìn)行治療的D組大鼠心臟功能得到了有效改善。

光鏡下觀察各組大鼠在心臟缺血再灌注之后心肌細(xì)胞出現(xiàn)炎癥情況發(fā)現(xiàn), 心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。文獻(xiàn)報(bào)道［5］, 冠狀動(dòng)脈堵塞后, 心肌組織缺血區(qū)會(huì)有大量白細(xì)胞的聚集, 且再灌注后白細(xì)胞數(shù)目不但沒有減少反而有增多的趨勢(shì)。心肌組織缺血較輕的區(qū)域白細(xì)胞聚集數(shù)目也較少。研究表明, 心臟缺血再灌注時(shí)心肌組織內(nèi)白細(xì)胞的聚集機(jī)制可能與胞內(nèi)鈣離子濃度升高有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)中觀察各組大鼠心肌細(xì)胞炎癥因子表達(dá)情況, 致炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)在心臟缺血再灌注之后有明顯的提高, 而抗炎因子IL-10和TGF-β1在缺血再灌注之后一直低水平表達(dá), 因此心肌細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。TNF-α能夠激活和聚集心肌細(xì)胞中白細(xì)胞, 增強(qiáng)白細(xì)胞的吞噬能力, 促進(jìn)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附作用, 從而引起心肌炎癥［6］；IL-1β可激活炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng), 活化中性粒細(xì)胞,上調(diào)粘附因子的表達(dá), 促進(jìn)TNF-α介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)；IL-6能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞的增殖與分化, 促進(jìn)中性粒細(xì)胞的分化［7］。IL-10和TGF-β1均具有免疫抑制作用, 通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞因子, 抑制炎癥反應(yīng)［8］。

綜上所述, 心臟出現(xiàn)缺血再灌注之后, 地爾硫卓可以有效抑制炎癥細(xì)胞的活化和炎癥因子的分泌, 減輕心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng), 改善心臟功能, 為地爾硫卓臨床治療心臟缺血再灌注后心肌炎癥提供了理論基礎(chǔ)。

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