樸明姬

阿托伐他汀對腎間質(zhì)纖維化大鼠腎臟Toll樣受體4表達(dá)的影響

樸明姬

目的觀察阿托伐他汀對腎間質(zhì)纖維化大鼠模型的腎組織Toll樣受體4(TLR4)表達(dá)的影響。方法40只10周齡 SD 大鼠隨機(jī)分為4 組:假手術(shù)組、單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)組和治療組(分為小劑量阿托伐他汀組和大劑量阿托伐他汀組)。左側(cè)輸尿管結(jié)扎法制作腎間質(zhì)纖維化大鼠動物模型。Masson染色觀察和評價腎組織炎癥、纖維化程度。免疫組化SP法檢測梗阻側(cè)腎組織TLR4表達(dá)部位和強(qiáng)度, ELISA法檢測腫瘤壞死因子(TNF-α)的含量。結(jié)果假手術(shù)組左腎組織炎癥浸潤不明顯, UUO組有大量炎性細(xì)胞浸潤, 并出現(xiàn)明顯的間質(zhì)纖維化；小劑量阿托伐他汀組和大劑量阿托伐他汀組較UUO組腎間質(zhì)纖維化明顯減輕, 但兩組間無顯著性差異；與UUO組比較, 兩治療組的腎功、腎組織TLR4和TNF-α含量顯著下降 , 但小劑量和大劑量治療組間無顯著性差異。各組間血脂無顯著性差異。結(jié)論腎組織TLR4和TNF-α在腎間質(zhì)纖維化發(fā)病過程中起著重要的作用, 阿托伐他汀可以通過非降脂相關(guān)的機(jī)制延緩腎間質(zhì)纖維化。

腎間質(zhì)纖維化；阿托伐他??；Toll樣蛋白4；TNF-α

腎間質(zhì)纖維化是各種炎癥和非炎癥性腎臟疾病進(jìn)展的最終結(jié)局, 是所有慢性進(jìn)行性腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎衰竭的共同形態(tài)學(xué)特點, 是導(dǎo)致終末期腎衰竭的重要原因之二［1］。目前認(rèn)為腎間質(zhì)纖維化受多方面因素的影響, 近年免疫、炎癥學(xué)說倍受關(guān)注。Toll樣受體(Toll-1ike receptors, TLRs)被認(rèn)為是目前哺乳動物唯一將細(xì)胞外抗原識別信息向細(xì)胞內(nèi)傳遞并引發(fā)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵跨膜蛋白［2］, 是參與免疫炎癥反應(yīng)的一個關(guān)鍵因素, 現(xiàn)認(rèn)為TLR是介導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng)的主體。本實驗以單側(cè)輸尿管梗阻模型為研究對象, 研究阿托伐他汀在大鼠腎間質(zhì)纖維化中對TLR4和TNF-α的影響, 以探討阿托伐他汀對腎間質(zhì)纖維化的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 SD雌性大鼠40只, 體重200～220 g(大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)。實驗前于本院動物實驗中心飼養(yǎng)兩周, 飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級。制模型前禁食水12 h。

1.2方法

1.2.1動物模型的建立與標(biāo)本采集 雌性大鼠40只 隨機(jī)分為4組: 假手術(shù)組、UUO組、小劑量阿托伐他汀組(20 mg/(kg·d)、大劑量阿托伐他汀組(50 mg/(kg·d), 阿托伐他汀(立普妥,由輝瑞制藥有限公司提供)。10%水合氯醛0.4 ml·(100 g)-1腹腔注射麻醉, 打開腹腔沿左腎下極尋找到左輸尿管, 用4.0絲線上下結(jié)扎兩處, 然后從中剪斷輸尿管以防逆行性感染。假手術(shù)組大鼠打開腹腔后分離左側(cè)輸尿管但不結(jié)扎, 隨即關(guān)閉腹腔。各藥物治療組均于術(shù)前1 d開始用相應(yīng)藥物等量灌胃, 共計給藥14 d。假手術(shù)組和UUO組以等量蒸餾水灌胃14 d。第14天各組大鼠腹主動脈取血制備血清, 測定血尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)和血脂, 取左側(cè)腎組織, - 80℃冰箱保存,取左側(cè)腎組織用10%中性甲醛溶液固定, 常規(guī)方法制備切片行病理檢查。

1.2.2病理學(xué)觀察 左側(cè)腎組織行HE及Masson染色, 光鏡觀察腎間質(zhì)纖維化情況。取Masson染色切片, 每張切片觀察腎皮質(zhì)中8個不含腎小球高倍鏡視野(×400), 以MAP IS-500多媒體病理彩色分析系統(tǒng)計算每例切片腎間質(zhì)綠染面積占整個視野百分比, 對腎間質(zhì)纖維化定量分析。

1.2.3ELISA雙抗體夾心法測定左腎組織TNF-α 取左腎組織用PBS液沖洗、稀釋、制成勻漿, 離心取上清液測定TNF-α含量(試劑盒購自美國RD公司)。

1.2.4免疫組化SP法檢測TLR4 的定位和表達(dá) 石蠟切片4 μm厚, 脫蠟后3%過氧化氫液封閉過氧化物酶, 行微波抗原修復(fù), 血清封閉, 再逐步加TLR4抗體, 生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG及辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素(試劑盒購自Abcam公司), 最后經(jīng)DAB溶液顯色。陰性對照除了用PBS代替抗TLR4抗體外, 所有步驟同上, 以細(xì)胞漿有棕黃色顆粒沉著為陽性細(xì)胞。每張玻片隨機(jī)選擇20個視野(×200),利用圖像分析系統(tǒng)(HIPAS-2000)進(jìn)行吸光度測量并自動轉(zhuǎn)換為A值, 每個標(biāo)本的TLR4表達(dá)強(qiáng)度用20個視野的平均A值表示。

1.2.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件, 實驗數(shù)據(jù)以( x-±s)表示, 組間兩兩比較采用q檢驗, 各組間比較采用單因素方差分析, 以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1測定血BUN、Scr、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)水平變化 與假手術(shù)組比較, UUO組血BUN、Scr顯著性升高(P＜0.05)；與UUO組比較, 小劑量組和大劑量組顯著性下降(P＜0.05)；小劑量組和大劑量組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。各組間TC、TG、LDL差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05), 見表1。

2.2腎臟病理改變 HE染色中UUO組左側(cè)腎組織可見腎間質(zhì)水腫、纖維化, 遠(yuǎn)端腎小管與近曲小管均擴(kuò)張, 部分萎縮壞死, 見大量纖維細(xì)胞增生和淋巴單核細(xì)胞浸潤出現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化, 但腎小球無明顯改變。低劑量阿托伐他汀組和大劑量阿托伐他汀組有輕度腎小管上皮萎縮, 腎小管擴(kuò)張, 間質(zhì)中有單核細(xì)胞浸潤, 腎間質(zhì)纖維化程度明顯輕于UUO組。Masson染色顯示, 與假手術(shù)組比較, UUO組膠原面積百分比顯著性增多；與UUO組比較, 小劑量組和大劑量組膠原面積百分比顯著性下降(P＜0.05)；但兩治療組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05), 見表2。

表14組大鼠 BUN、Scr、TC、TG、LDL測定結(jié)果

表14組大鼠 BUN、Scr、TC、TG、LDL測定結(jié)果

注：與假手術(shù)組比較,aP＜0.05；與UUO組比較,bP＜0.05

組別BUN(mmol/ L)Scr(μmol/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)LDL(mmol/L)假手術(shù)組4.27±0.8147.53±6.121.44±0.260.69±0.20.46±0.03 UUO組10.67±2.32a103.4±12.19a1.39±0.340.71±0.090.53±0.06小劑量組6.84±2.05b83.59±7.46b1.24±0.280.68±0.040.49±0.07大劑量組7.01±2.08b79.98±11.42b1.29±0.190.62±0.070.41±0.05

表24組大鼠腎組織膠原沉積、TLR4表達(dá)水平和TNF-α含量的比較

表24組大鼠腎組織膠原沉積、TLR4表達(dá)水平和TNF-α含量的比較

注: 與假手術(shù)組比較,aP＜0.05; 與UUO 組比較,bP＜0.05

組別膠原面積百分比(%)TLR4TNF-α(μg/L )假手術(shù)組0.8 ±0.054.28 ±0.9534.35 ±9.15 U U O 組25.67 ±3.83a11.57 ±0.05a98.54 ±13.74a小劑量組19.37 ±4.32b8.54 ±1.59b69.58 ±10.04b大劑量組20.12 ±4.28b9.08 ±2.75b71.43 ±11.47b

2.3各組大鼠腎組織TLR4表達(dá)和TNF-α含量結(jié)果(見表2)TLR4在假手術(shù)組大鼠腎臟組織中主要分布在腎近曲小管、遠(yuǎn)曲小管、集合管、腎間質(zhì)區(qū)、腎血管等部位, 在腎小球系膜區(qū)也有一定的表達(dá)。UUO組大鼠TLR4在上述區(qū)域的表達(dá)顯著升高, 尤其以腎小管及腎間質(zhì)區(qū)增加最為明顯。與假手術(shù)組比較, UUO組TLR4、TNF-α顯著性升高(P＜0.05)；與UUO組比較, 小劑量組和大劑量組顯著性下降(P＜0.05)；小劑量組和大劑量組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

Toll樣受體最早發(fā)現(xiàn)于果蠅胚胎中, 是識別病原微生物的跨膜受體家族, 在免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［3］。Toll樣受體的生物學(xué)功能有：①調(diào)理病原微生物的吞噬作用；②參與抗原提呈細(xì)胞(APC)對病原體的識別過程；③激發(fā)多種免疫應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄, 如某些炎癥性細(xì)胞因子、共刺激分子等；④促發(fā)胞內(nèi)的殺菌機(jī)制。TLR4是TLR家族的重要成員, 定位于人染色體9q32-q33上, 它的天然配體是脂多糖(LPS)、脂質(zhì)磷壁酸(LTA)、HSP(熱休克蛋白)60、HSP(熱休克蛋白)70等［4］。內(nèi)源性配體能夠激活TLR4, 活化的TLR4及相關(guān)配體誘導(dǎo)核因子KB激活, 啟動白介素-1、白介素-6、白介素-8、白介素-12、TNF-α及CD80與CD86等基因的轉(zhuǎn)錄, 介導(dǎo)各種病原體的識別和免疫活化過程, 從而導(dǎo)致腎臟損傷［5,6］。Tsuboi N等在培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)有TLR4 的表達(dá), 受到LPS 刺激后,細(xì)胞TLR4表達(dá)增多, NF-κB活性增強(qiáng), 最后產(chǎn)生相關(guān)細(xì)胞因子, 啟動免疫應(yīng)答［7］。TNF-α是單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種重要的細(xì)胞因子, 參與炎癥病變的多方面病理生理學(xué)變化,如何阻斷TNF-α是控制慢性炎癥的關(guān)鍵。本實驗結(jié)果表明, UUO大鼠腎組織TLR4和TNF-α明顯升高, 這與文獻(xiàn)結(jié)果一致。

阿托伐他汀是屬于HMG-coA(丙戊二酸輔酶A)抑制劑,是臨床上常見的降脂藥物。近年發(fā)現(xiàn)這類藥物除了降脂作用,還存在非降脂相關(guān)的腎保護(hù)作用。這主要表現(xiàn)為以下幾方面：①抗細(xì)胞增殖［8］：能抑制腎小球系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞, 血管平滑肌細(xì)胞等增殖；促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分泌, 促進(jìn)基質(zhì)蛋白的降解［9］。②抗炎癥作用：抑制單核巨噬細(xì)胞在腎血管周圍和腎間質(zhì)的浸潤, 抑制4型膠原的表達(dá), 在細(xì)胞水平, 可以抑制炎癥細(xì)胞和腎臟固有細(xì)胞合成和分泌各種炎癥因子［10］。③調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答：作用于各種炎癥細(xì)胞的聚集、分化、增殖和分泌活動。本實驗發(fā)現(xiàn), 小劑量和大劑量阿托伐他汀組的腎組織TLR4蛋白和TNF-α較UUO組顯著降低, 提示阿托伐他汀可能通過下調(diào)TLR4蛋白和TNF-α, 從而減輕炎癥反應(yīng), 延緩腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展。本研究還發(fā)現(xiàn)采用阿托伐他汀兩種劑量并未顯著影響大鼠血脂水平, 小劑量和大劑量組間TLR4蛋白和TNF-α無顯著性差異, 提示阿托伐他汀可以通過非降脂相關(guān)的機(jī)制延緩腎間質(zhì)纖維化, UUO模型中阿托伐他汀改善腎間質(zhì)纖維化的作用并無明顯的劑量依賴性。

綜上所述, 阿托伐他汀可以通過非降血脂機(jī)制延緩腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展, 這與下調(diào)TLR4和TNF-α途徑有著重要的聯(lián)系。這對早期防治腎間質(zhì)纖維化有重要的臨床意義。

［1］ Nishiyama A.Abe Y.Molecular mechanisms and therapeutic strategies of chronic renal injury: renoprotective effects of sldosterone blockade.J pharmacol Sci, 2006,100(1):9-1.

［2］ Gordon S, Pattem recognition receptors: doubling up for the innateimmune response.Cell, 2002,111(7):927-930.

［3］ Takeda K, Kaisho S, Akiiras.Toll like receptors.Ann Rev Immunol, 2003,2(1):335-376.

［4］ Janssens S, Beyaert R.Role of Toll-like receptors in pathogen recognition.Clin Microbiol Rev, 2003,16(4):637-646.

［5］ Hans-Joachim A, Bernhard B, Detlef S.Signaling danger: Toll-Like receptors and their potential roles in kidney disease.J Am SocNephrol, 2004,15(4):854-867.

［6］ Velasco G, Campo M, Manrique OJ, et al.Toll like receptor 4 or 2 agonist s decrease allergic inflammation.Am J Respir Cell Mol Biol, 2005,32(3):218-224.

［7］ Nitschke M, Wiehl S, Baer PC, et al.Bactericidal activity of renal tubular cetive role of human beta-de-fensins.Immunol J, 2002,10 (5-6):332-337.

［8］ Nishimura M, Tanaka T, Yasuda T, et al.Collagen secretion and growth of mesangial cells require geranylgeranylpyrophosphate.Kidney international, 1999, 55(2):520-528.

［9］ Nogaki F, Muso E, Yashiro M, et al.Direct inhibitory effects of simvastatin on matrix accumulation in cultured murine mesangial cells.Kidney International, 1999(56):S198-S201.

［10］ Musial J, Undas A, Gajewski P, et al.Anti-inflammatory effects of simvastatin in subjects with hypercholesterolemia.International journal of cardiology, 2001, 77(2):247-253.

116001 大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院腎內(nèi)科