張陽旸　吳正鈞　劉景　王淵龍　任婧

摘要：從嗜冷菌細胞膜流動性、產(chǎn)冷休克蛋白、冷適應酶3個方面詳細闡述了嗜冷菌的嗜冷機制，并介紹了乳制品中嗜冷菌的種類及其對乳品質(zhì)量的影響。

關鍵詞：嗜冷菌；嗜冷機制；乳制品；水解酶

中圖分類號： TS201.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）02-0012-03

收稿日期：2013-06-10

基金項目：國家“973”計劃（編號：2012CB723706）；國家科技支撐計劃（編號：2012BAD12B08）。

作者簡介：張陽旸（1989—），女，江蘇無錫人，碩士研究生，研究方向為微生物學與分子生物學。E-mail：zhyy_1018@sina.com。

通信作者：任婧，高級工程師，研究方向為乳酸菌分子生物學。E-mail：renjing@brightdairy.com。嗜冷微生物（psychrophilic microorganism）廣泛分布在極地、高山、冰川、深海、凍土、冷庫等低溫環(huán)境中。1887年，F(xiàn)orster 首次發(fā)現(xiàn)了在低溫下生長的微生物，這種微生物能夠在冰點溫度下生長繁殖。此后，科學家從自然界生物中陸續(xù)分離出了不同種類的嗜冷微生物。Morita根據(jù)嗜冷微生物各自不同的生長溫度將它們細分為2類，將最高生長溫度不超過20 ℃、15 ℃以下生長旺盛、能夠在0 ℃生長繁殖的微生物定義為專性嗜冷菌（psychrotrophile），從極端低溫環(huán)境中分離出的嗜冷菌通常為專性嗜冷菌；將在低于5 ℃下能夠生長，最高生長溫度在20 ℃以上的嗜冷微生物定義為兼性嗜冷菌（psychrotroph），食品中的腐敗菌大部分為兼性嗜冷菌[1]，這種分類方法已被生物界廣泛認可。 目前，已有不少關于嗜冷菌檢測研究，但從分子水平對嗜冷菌嗜冷機制研究較為少見。本研究從細胞表層結(jié)構(gòu)、冷休克蛋白、酶3個方面系統(tǒng)闡述近年來國內(nèi)外嗜冷菌嗜冷機制的研究進展，并討論嗜冷菌對乳品質(zhì)量的影響。

1嗜冷菌的嗜冷機制

1.1細胞表層結(jié)構(gòu)

微生物在低溫條件下能否生長，取決于其細胞在低溫條件下能否轉(zhuǎn)運外源營養(yǎng)物質(zhì)進入細胞參與一系列反應。細胞膜的作用就是參與細胞內(nèi)外的物質(zhì)交換，它通過膜上的鑲嵌蛋白來吸收外部營養(yǎng)、交換電子、傳輸信號，從而保證細胞內(nèi)正常的生化反應。鑲嵌蛋白的功能與膜的流動性息息相關，細胞膜的流動性以及相結(jié)構(gòu)又是由膜脂組成決定的。因此在嗜冷菌眾多適應低溫環(huán)境的機制中，最為重要的一個就是調(diào)節(jié)膜脂的組成。當溫度改變時，微生物需要調(diào)節(jié)其細胞膜脂類的組成，保證其胞膜的流動性，來適應環(huán)境溫度的變化。有學者通過對嗜冷菌P.arcticusstrain 273-4的基因組進行測序，發(fā)現(xiàn)了有關脂肪酸合成的基因、控制鏈長的基因，表明不飽和脂肪酸的生成是P.arcticusstrain 273-4在低溫下生存的一個重要原因。Diaz等發(fā)現(xiàn)，處于低溫環(huán)境下的枯草芽孢桿菌能利用脂肪酸去飽和酶將胞膜中的飽和脂肪酸轉(zhuǎn)變成不飽和脂肪酸，改變了支鏈脂肪酸的含量，同時，枯草芽孢桿菌的胞膜流動性也隨之增長[2]。此外，同分異構(gòu)的脂肪酸也會影響胞膜的流動性。與相應的異式支鏈脂肪酸比較而言，反異式支鏈脂肪酸在增加膜流動性方面的作用更為明顯[3]。因此，類似枯草芽孢桿菌這樣的革蘭氏陰性菌在受到低溫刺激時，能夠通過增加膜脂組分中的不飽和脂肪酸、反異式脂肪酸的量來維持、修復胞膜的流動性。藍藻細菌在寒冷環(huán)境下，能夠通過消耗單不飽和脂肪酸來增加多元不飽和脂肪酸的量，從而保證了細胞在低溫下的正常生長，這說明膜脂中的多元不飽和脂肪酸、脂肪酸脫飽和酶對于藍藻細菌適應低溫環(huán)境是很必要的[4]。嗜冷菌Pseudomonas syringae Lz4W在 28 ℃ 下測得的飽和脂肪酸、反式結(jié)構(gòu)的單一不飽和脂肪酸的量與5 ℃時所測的量相比有一定增加[5]。此外，嗜冷菌也能夠通過調(diào)節(jié)膜上極性頭、類胡蘿卜素類型、脂肪酸鏈長度、正式反式脂肪酸的比例來對其細胞膜流動性進行調(diào)節(jié)[6]。例如，Jagannadham 等在對嗜冷菌Sphingobacterium antarcticus MTCC 675的研究中發(fā)現(xiàn)，細胞在5 ℃下生長時，其不飽和脂肪酸、支鏈脂肪酸含量有所增加，這引起了胞膜流動性的增加。同時，胞膜堆積的極性類胡蘿卜素能夠促進膜穩(wěn)定并能夠克服脂肪酸的液化作用，嗜冷菌在5 ℃時能夠合成大量極性類胡蘿卜素，這些色素很有可能根據(jù)溫度的改變來穩(wěn)定膜的流動性[7]。近年來一些研究結(jié)果表明，上述機制并不全部有效。Suutari等研究發(fā)現(xiàn)，極性頭的改變在調(diào)整膜流動性上并沒有太大效果[8]。Denich等認為，脂肪鏈長度的改變可能只會影響細胞的生長[9]。Epand研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)雖然能和脂肪相互作用從而影響膜流動穩(wěn)定性，但這個互相作用的過程依然要依賴膜流動性與厚度[10]。脂肪酸的異構(gòu)化、飽和度變化是低溫下影響膜流動性的主要因素。

1.2冷休克蛋白和抗凍蛋白的合成

Jones等在培養(yǎng)大腸桿菌時發(fā)現(xiàn)，當培養(yǎng)溫度急劇下降時，細胞會產(chǎn)生冷休克反應[11]。這種反應能使一些蛋白質(zhì)順勢表達從而使細菌適應生長。這種蛋白質(zhì)被稱為冷休克蛋白CSPs（cold-shock protein）。這種蛋白質(zhì)參與了細胞的很多生理活動，如轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白折疊等[12]。冷休克蛋白包括核酸分子伴侶、 RNA解旋酶、拓撲異構(gòu)酶、促旋酶亞基A、H-NS[13]。盡管嗜冷菌中冷激蛋白作用機制研究仍處于初步階段，但是與其相似的嗜中溫細菌冷休克蛋白作用機制已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。冷休克蛋白的誘導生成數(shù)量及種類與溫度變化的劇烈程度密切相關，溫度變動越大，產(chǎn)生的冷休克蛋白越多。學者普遍認為，低溫微生物面對低溫環(huán)境時，冷休克蛋白可作為RNA的分子伴侶與mRNA結(jié)合，在低溫條件下穩(wěn)定mRNA并促進翻譯，從而使低溫微生物適應低溫生長[14]。但是，常溫菌、嗜冷菌對冷刺激的反應是有差異的。常溫菌中發(fā)現(xiàn)的很多冷休克蛋白的作用相當于嗜冷菌中的冷適應蛋白，在低溫下能夠持續(xù)表達而不是短暫的作用，因此，關于嗜冷菌冷休克蛋白的作用機制仍有待進一步研究?？箖龅鞍?AFPs（antifreeze proteins）是具有提高生物抗凍能力的蛋白質(zhì)類化合物的總稱。Yamashita首次在南極地區(qū)的細菌中發(fā)現(xiàn)了AFPs的存在。在耐低溫生物中，AFPs 能與冰晶相結(jié)合，可以遏制體液內(nèi)冰核的形成與生長，維持體液的非冰凍狀態(tài)。近年來，科學家們對嗜冷細菌中的AFPs與低溫適應性間的關系進行了研究。研究人員在南極湖泊中的Marinomonas primoryensis中發(fā)現(xiàn)了AFPs的存在，這種AFPs依賴Ca2+，使得Marinomonas primoryensis在南極冰湖中免受低溫的影響。

1.3嗜冷菌產(chǎn)生的酶

生物的生命活動需要酶的參與，酶能夠催化細胞內(nèi)上百個化學反應，對生物體維持生命活動極為重要，因此嗜冷菌在低溫下生長需要在寒冷環(huán)境中具有活性的酶。嗜冷菌細胞內(nèi)產(chǎn)生的具有冷適應性的酶被稱為嗜冷酶或者冷活性酶（cold adapted enzyme）。1975年，Morita最早報道了海產(chǎn)弧菌中分離出的蘋果酸脫氫酶，這種酶在15～20 ℃具有活性，超過 20 ℃ 會很快失去活性[1]。近年來，一些其他種類的冷活性酶陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，包括α-淀粉酶、β-半乳糖苷酶等[15]。低溫酶分子結(jié)構(gòu)一般柔性較高，在低溫條件下更容易展開，這就為一些冷適應酶的高活性提供了合理的解釋[16]。有學者從嗜冷菌、常溫菌中分離出冷活性酶，比較這2種酶的氨基酸組成發(fā)現(xiàn)，酶適應低溫的條件包括較少的脯氨酸或精氨酸殘基量等[17]。此外，Brenchley等發(fā)現(xiàn)，1株嗜冷菌產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶同工酶具有不同的最適溫度，因此，產(chǎn)生不同類型的同工酶可能也是嗜冷微生物適應低溫的方式之一[18]。低溫菌產(chǎn)生的蛋白酶活化能、最適酶活溫度都比較低，可以在較低的溫度下催化體內(nèi)生理生化反應。0～30 ℃條件下，嗜冷菌的酶催化速度常數(shù)、生理效率相對中溫微生物的酶來說高出很多，這樣，由于低溫引起的細胞生化反應速率降低就能通過酶的高催化率得到彌補，從而保證細胞在低溫下維持正常的生長過程[19]。這些酶的應用前景對于生物工業(yè)來說是很可觀的，例如在清潔劑、食品工業(yè)、精細化學、生物修復領域都有一定的發(fā)展?jié)摿20]。

2嗜冷菌對牛乳質(zhì)量的影響

由于嗜冷菌的生長繁殖不受低溫環(huán)境的限制，廣泛分布在各種各樣的環(huán)境中，從而能夠通過各種途徑進入食品中，危害食品質(zhì)量。

2.1牛乳中的嗜冷菌

牛乳中的嗜冷菌幾乎覆蓋了牛乳中常見的所有類群細菌，主要包括：假單胞菌屬（Pseudomonas）、無色桿菌屬（Achromobacter）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、沙雷氏菌屬（Serratia）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）、色桿菌屬（Chromobacterium）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、梭菌屬（Clostridium）、棒狀桿菌屬（Coryncbacterium）、鏈球菌屬（Streptococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、微球菌屬（Microbacterium），其中假單胞菌屬占主導地位[21-22]。

2.2嗜冷菌對牛乳質(zhì)量的影響

大多數(shù)嗜冷菌能產(chǎn)生耐熱水解酶，這些水解酶能破壞牛乳的主要成分，這些酶在常規(guī)熱處理后還能夠保持30%～100%的活性。這些水解耐熱酶主要來自于假單胞菌屬、芽孢桿菌屬。嗜冷菌分泌的蛋白酶能夠水解酪蛋白，促使牛乳形成凝膠結(jié)構(gòu)，從而使其在儲藏過程中凝固變質(zhì)。此外，蛋白水解對牛乳產(chǎn)品的風味會產(chǎn)生不利影響，例如苦味、異味、果味、酵母味[23]。嗜冷菌分泌的脂肪酶水解牛乳脂肪過程中，一些游離脂肪酸被釋放出來，這些脂肪酸是造成牛乳制品腐臭、異味、堿味的主要原因。這種脂肪水解產(chǎn)生的風味缺陷在牛乳及其他一些乳制品如奶油、黃油、干酪中體現(xiàn)尤為明顯[24]。卵磷脂酵素及其他磷脂酶能夠破壞脂肪球膜，使得牛乳中的脂肪被釋放出來，被體系中原本存在的脂肪酶分解，導致牛乳乳化變質(zhì)。嗜冷菌分泌的脂肪酶分子量為30～50 ku，最適pH值為7～9[25]。近年來，關于嗜冷菌產(chǎn)生的耐熱酶及其對牛乳質(zhì)量的影響研究已經(jīng)有很多，但關于這些耐熱酶的合成機制，目前尚沒有完整明確的解釋。因而，從酶機制方面來解決牛乳質(zhì)量問題仍有一定難度。

2.3控制方法

嗜冷菌在低溫下仍能夠快速生長的特性導致這些腐敗菌在牛乳中廣泛存在，即使是最嚴苛的加工條件，也無法完全避免牛乳中嗜冷菌造成的污染。Kumarsan等研究了牛乳在不同儲藏溫度下的腐敗程度，結(jié)果表明，采用2 ℃作為牛乳的儲藏溫度來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的4～6 ℃儲藏溫度能有效減緩嗜冷菌的生長速度，同時也能夠降低嗜冷菌分泌的蛋白酶、脂肪酶活性[26]。但是，這種通過低溫降低嗜冷菌生長速度的處理方法有一定的局限性，熱處理對嗜冷菌也有一定的抑制作用，Champagne等發(fā)現(xiàn)，巴氏殺菌前若將原料乳在65～69 ℃下處理 15 s，能夠使革蘭氏陰性嗜冷菌數(shù)量減少77%～79%，但是，這種預處理方式對產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性嗜冷菌沒有作用[27]。此外，乳品工業(yè)生產(chǎn)中的灌裝設備是最常見的嗜冷菌污染來源，因此，對灌裝設備進行衛(wèi)生控制是保證乳品質(zhì)量的重要手段。Eneroth曾提出假設，即產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性嗜冷菌能夠存在于生產(chǎn)過程中的死角、工廠設備表面的生物膜上，它造成的產(chǎn)品污染存在于整個牛乳加工過程中。這種產(chǎn)芽孢菌相構(gòu)成非常復雜，很難將它們從牛乳中分離出并定義其生長特性。在這層意義上，若將牛乳冷藏、高溫熱處理、離心除菌相結(jié)合，并使用容易清潔的乳品工業(yè)生產(chǎn)設備，能夠有效減少嗜冷菌對產(chǎn)品的污染。無論是革蘭氏陽性嗜冷菌還是革蘭氏陰性嗜冷菌，在生產(chǎn)過程中應用HACCP或者其他相似的質(zhì)量控制系統(tǒng)來控制產(chǎn)品的質(zhì)量仍然是最有效的措施，但是，根據(jù)乳制品的不同種類，采用特異的控制措施也是必要的。

3結(jié)論

近年來，由于生物化學、分子生物學技術的發(fā)展，學者們對嗜冷菌嗜冷機制有了更深入的研究。目前的研究還不能明確闡述嗜冷菌內(nèi)部化學結(jié)構(gòu)與冷適應之間的關系，這些都將是今后的研究熱點。對于食品工業(yè)中具有危害性的嗜冷菌，目前關于其產(chǎn)生的耐熱酶研究已經(jīng)很多，需要在基因、分子水平上對乳品中嗜冷菌的嗜冷機制進行深入研究，從根本上減輕嗜冷菌的危害。

參考文獻：

[1]Morita R Y. Psychrophilic bacteria [J]. Bacteriological Reviews，1975，39：144-167.

[2]Diaz A R，Mansilla M C，Vila A J，et al. Membrane topology of the acyl-lipid desaturase from Bacillus subtilis[J]. Journal of Biological Chemistry，2002，277（50）：48099-48106.

[3]Kaneda T. Iso- and anteiso-fatty acids in bacteria：biosynthesis，function，and taxonomic significance[J]. Microbiological Reviews，1991，55（2）：288-302.

[4]Nishida I，Murata N. Chilling sensitivity in plants and cyanobacteria：the crucial contribution of membrane lipids[J]. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology，1996，47：541-568.

[5]Kiran M D，Annapoorni S，Suzuki I，et al. Cis-trans isomerase gene in psychrophilic Pseudomonas syringae is constitutively expressed during growth and under conditions of temperature and solvent stress[J]. Extremophiles，2005，9（2）：117-125.

[6]Chintalapati S，Kiran M D，Shivaji S. Role of membrane lipid fatty acids in cold adaption[J]. Cellular and Molecular Biology，2004，50（5）：631-642.

[7] Jagannadham M V，Chattopadhyay M K，Subbalakshmi C，et al. Carotenoids of an Antarctic psychrotolerant bacterium，Sphingobacterium antarcticus，and a mesophilic bacterium，Sphingobacterium multivorum[J]. Archives of Microbiology，2000，173（5/6）：418-424.

[8]Suutari M，Laakso S. Microbial fatty acids and thermal adaption[J]. Critical Reviews in Microbiology，1994，20（4）：285-328.

[9] Denich T J，Beaudette L A，Lee H，et al. Effect of selected environmental and physico-chemical factors on bacterial cytoplasmic membranes[J]. Journal of Microbiological Methods，2003，52（2）：149-182.

[10]Epand R M. Lipid polymorphism and protein-lipid interactions[J]. Biochim Biophys Acta，1998，1376（3）：353-368.

[11]Jones P G，Inouye M. The cold-shock response—a hot topic[J]. Molecular Microbiology，1994，11（5）：811-818.

[12]Phadtare S. Recent developments in bacterial cold-shock response[J]. Current Issues in Molecular Biology，2004，6（2）：125-136.

[13]Eriksson S，Hurme R，Rhen M. Low-temperature sensors in bacteria[J]. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，2002，357（1423）：887-893.

[14] Margesin R，Schinner F. Properties of cold-adapted microorganisms and their potentialrole in biotechnology[J]. Journal of Biotechnology，1994，33（1）：1-14.

[15]Groudieva T，Kambourova M，Yusef H，et al. Diversity and cold-active hydrolytic enzymes of culturable bacteria associated with Arctic sea ice，Spitzbergen[J]. Extremophiles，2004，8（6）：475-488.

[16]唐赟. 嗜冷菌適應低溫的分子機制及其應用[J]. 西華師范大學學報：自然科學版，2004，25（4）：388-393.

[17]Damico S，Claverie P，Collins T，et al. Molecular basis of cold adaptation[J]. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，2002，357（1423）：917-925.