李 輝， 張 波， 竇 爽 ， 宋有濤,2*

(1.遼寧大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽 110036；2.遼寧大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，遼寧 沈陽 110036)

NaF、NaBr、NaI對酵母朊病毒[PSI+]形成的影響

李 輝1， 張 波1， 竇 爽1， 宋有濤1,2*

(1.遼寧大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽 110036；2.遼寧大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，遼寧 沈陽 110036)

為研究NaF、NaBr、NaI對酵母朊病毒[PSI+]形成的影響，利用表達(dá)融合蛋白GFP-Sup35p酵母朊病毒模型，借助半變性瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，結(jié)合免疫印跡方法在蛋白水平上定量分析NaF、NaBr、NaI對酵母朊病毒[PSI+]形成的影響。結(jié)果顯示，在細(xì)胞表型方面NaF、NaBr誘導(dǎo)出酵母朊病毒[PSI+]，且所需濃度分別為0.02、1.0 mol/L；NaI在濃度為0.25mol/L可以誘導(dǎo)出[PSI+]經(jīng)鹽酸胍治愈后的酵母朊病毒[psi-]。在蛋白水平，NaF、NaBr、NaI鹽作用后的[psi-]細(xì)胞內(nèi)Sup35p并沒有形成聚集體。

酵母朊病毒；[PSI+]；聚集體

朊病毒是一類能在哺乳動(dòng)物中引起瘋牛病、綿羊瘙癢癥，以及人類克雅氏病等可傳染性的海綿羊腦病的病原體。迄今為止，對于朊病毒的疾病仍缺乏有效的治療藥物[1-2]。生態(tài)學(xué)的觀點(diǎn)認(rèn)為，生命與環(huán)境之間發(fā)生著不可分割的聯(lián)系，已知所有的生命都受到環(huán)境的影響，研究發(fā)現(xiàn)，朊病毒不僅存在于哺乳動(dòng)物中，也存在于自然界其他的物種中[3]。釀酒酵母(S.cerevisiae) 中也含有2種具有動(dòng)物朊病毒特性的朊病毒狀蛋白[PSI+](由翻譯終止因子Sup35p引起)和[URE3](由氮代謝的調(diào)節(jié)蛋白Ure2p引起)，它們雖然在序列上與動(dòng)物朊病毒不同源，但可以自我復(fù)制并具有傳染和遺傳特性，并且這種特性在數(shù)百萬年的真菌進(jìn)化中一直存在[4-5]。這些酵母朊病毒能夠在體內(nèi)和體外形成淀粉狀纖維，并且在結(jié)構(gòu)上與動(dòng)物朊病毒形成的纖維具有很大的相似性，Wickner由此提出了“酵母朊病毒假說”[6-8]。由于酵母朊病毒[PSI+]具有和哺乳動(dòng)物朊病毒(Prp)相似的復(fù)制增殖機(jī)制、易于檢測的遺傳表型(紅色為朊病毒可溶狀態(tài)，白色為朊病毒聚集狀態(tài))及其與哺乳動(dòng)物種間屏障的優(yōu)勢，因此基于酵母細(xì)胞篩選抗朊病毒藥物的模型在大規(guī)模上篩選具有安全、經(jīng)濟(jì)和易實(shí)現(xiàn)高通量篩選等特性越來越受到廣大研究者的關(guān)注[9-12]。在酵母中，朊病毒[PSI+]使得一系列原本隱藏的遺傳變異顯現(xiàn)出來，并產(chǎn)生表現(xiàn)型有25%是有利表型。在基因組范圍內(nèi)高通量篩選能調(diào)節(jié)[PSI+]誘導(dǎo)率的基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因和應(yīng)激基因在這方面有獨(dú)特優(yōu)勢。其次測試不同突變菌株在不同環(huán)境下(如不同碳源和氮源)，[PSI+]與[psi-]細(xì)胞的生長速率。在150株突變體中，近一半菌株都是在朊病毒狀態(tài)下生長速率更快，并且生長速率增加了1/4左右。這些生長速率的不同跟它們本身的菌株特性及環(huán)境有關(guān)。通過比較測試，發(fā)現(xiàn)Sup35p的N和M結(jié)構(gòu)域是自然選擇傾向。通過在十幾種壓力條件(強(qiáng)氧化性、高濃度鹽環(huán)境)下測試，[psi-]細(xì)胞自發(fā)突變形成[PSI+]的概率增加。研究者提出假說：[PSI+]可作為一種緩沖使得酵母細(xì)胞在波動(dòng)的環(huán)境中生存并繁殖，從而促進(jìn)進(jìn)化[13-15]。另有研究表明[16]，在氯化鈉作用條件下，可形成酵母朊病毒[PSI+]表型，并在細(xì)胞表型和蛋白水平上得到相應(yīng)的驗(yàn)證。因此，本研究采用氟化鈉、溴化鈉、碘化鈉3種鹽作用酵母朊病毒[PSI+]，分析其對酵母朊病毒[PSI+]形成的影響，從而完善了研究鹵族鈉鹽形成酵母朊病毒[PSI+]的初步實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株 野生型酵母779-6A(NMC) ：MATαkar1SUQ5ade2-1his3Δ202leu2Δ1trp1Δ63ura3-52sup35::KanMX/pJ501，[PSI+]，由美國國立衛(wèi)生院 (NIH) Masison DC.博士惠贈(zèng)。重組型酵母(NGMC) ：MATαkar1SUQ5ade2-1his3Δ202leu2Δ1trp1Δ63ura3-52sup35::KanMX/pJ501，[GPSI+]，GFP基因插入SUP35基因的第123～124位之間，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①1/2YPD 培養(yǎng)基：酵母浸粉0.5%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，固體平板加入2%瓊脂；②YPD 培養(yǎng)基：酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，固體平板加入2%瓊脂；③SD-Ade( 腺嘌呤缺乏合成培養(yǎng)基) 固體培養(yǎng)基: 無氨基酸酵母氮源(YNB-AA) 7 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，倒平板前添加尿嘧啶、色氨酸、組氨酸和亮氨酸，使其終質(zhì)量濃度分別為20、20、20、60 mg/L；④YPAD 培養(yǎng)基：酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，腺嘌呤0.04%，固體平板加入2%瓊脂；⑤1/2YPD+GuHCl 固體培養(yǎng)基: 同1/2YPD，倒平板前添加鹽酸胍，使其終濃度為5mmol/L。

1.1.3 試劑 鹽酸胍購于Sigma公司；兔抗GFP抗體與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG 購于金斯特生物科技有限公司；酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂粉購自上海奧博星生物科技有限公司；氟化鈉、溴化鈉、碘化鈉、尿嘧啶、色氨酸、組氨酸、亮氨酸購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；腺嘌呤 購自美國Solarbio 公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞遺傳表型實(shí)驗(yàn) 在無菌操作條件下，挑取基因重組酵母菌[GPSI+]和經(jīng)5mmol/L鹽酸胍治愈的[Gpsi-]的單菌落于1/2YPD固體培養(yǎng)基及含NaF、NaBr、NaI 1/2YPD固體培養(yǎng)基上劃線，30 ℃培養(yǎng)2～5d，培養(yǎng)出單菌落。轉(zhuǎn)置室溫培養(yǎng)3 d，待菌落顏色不再變化時(shí)，備用。

1.2.2 NaF、NaBr、NaI 對酵母朊病毒[PSI+]表型的影響 在無菌操作條件下，分別在含有不同濃度NaF、NaBr、NaI的1/2YPD固體培養(yǎng)基上劃線，30 ℃恒溫培養(yǎng)2～5d，轉(zhuǎn)置于室溫下3 d，待顏色不再變化時(shí)，觀察結(jié)果(圖1)。

1.2.3 不同培養(yǎng)基[PSI+]酵母細(xì)胞的表型分析 在無菌操作條件下，挑取基因重組酵母菌[GPSI+]和[Gpsi-]在1/2YPD固體培養(yǎng)基上劃線，30 ℃恒溫培養(yǎng)2 d。將培養(yǎng)出的菌落分別影印到含有不同濃度NaF、NaBr、NaI的1/2YPD、SD-Ade固體培養(yǎng)基以及YPAD固體培養(yǎng)基上。將影印后的培養(yǎng)皿倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～5d，轉(zhuǎn)置于室溫下3 d，備用。將上步中含不同濃度NaF、NaBr、NaI的1/2YPD固體培養(yǎng)基上長出的菌落分別影印到不含NaF、NaBr、NaI的1/2YPD、SD-Ade固體培養(yǎng)基上。將培養(yǎng)皿倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～5d，轉(zhuǎn)置于室溫下3 d，待顏色不再變化時(shí)，觀察結(jié)果(圖2)。

1.2.4 在蛋白水平上定量分析酵母細(xì)胞[PSI+]的形成 將不含鹽的1/2YPD固體培養(yǎng)基培養(yǎng)出的白色單菌落活化后，接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30 ℃，至測菌液OD600=1.5時(shí)，停止培養(yǎng)。離心收集上清液后，加入裂解液及鎬珠，用珠磨儀破碎細(xì)胞，收集上清液得到蛋白樣品，-80 ℃保存；1.5%的半變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)束后在0 ℃、恒壓100 V條件下轉(zhuǎn)膜1 h，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，兔抗GFP抗原 (1∶ 2 000) 孵育1 h，4 ℃過夜，然后用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG (1∶ 5000)孵育1 h，采用ECL發(fā)光試劑盒對其進(jìn)行放射自顯影檢測，獲得圖像信息(圖3)。

2 結(jié)果與分析

在酵母細(xì)胞中，選用顏色變化作為酵母朊病毒[PSI+]表型的指示系統(tǒng)。其原理如下：酵母朊病毒[PSI+]的單體狀態(tài)是翻譯終止因子Sup35p(eRF 3)。在酵母細(xì)胞ade2-1(或ade1-14)突變體中，ADE基因的翻譯被人為突變的終止密碼子阻斷。在正常的酵母細(xì)胞[psi-]中，Sup35p為單體狀態(tài)，與Sup45p結(jié)合識(shí)別終止密碼子，從而行使翻譯終止因子的功能。在酵母細(xì)胞[psi-]中，由于這個(gè)翻譯過程被中斷，導(dǎo)致腺嘌呤代謝途徑副產(chǎn)物累積，在培養(yǎng)基上生長的ade2-1(或ade1-14)菌株形成紅色菌落；在酵母細(xì)胞[PSI+]中，Sup35p 為聚集狀態(tài)，不能與Sup45p結(jié)合識(shí)別終止密碼子，因而無法行使翻譯終止因子的功能，導(dǎo)致ADE2(或ADE1)基因進(jìn)行正常翻譯，代謝途徑中沒有副產(chǎn)物的積累，所以[PSI+]的ade2-1(或ade1-14)菌株在培養(yǎng)基上形成白色的菌落。根據(jù)這個(gè)原理，在本研究中選用顏色指示系統(tǒng)來探討NaF、NaBr、NaI對[PSI+]酵母細(xì)胞的形成。

2.13種鹽對酵母朊病毒[PSI+]遺傳表型分析結(jié)果

由圖1所示，在含有0.005、0.01、0.02、0.05mol/L NaF的1/2YPD固體培養(yǎng)基上，酵母細(xì)胞[psi-]隨著NaF濃度的增加，由最初的紅色開始向白色轉(zhuǎn)變，當(dāng)其濃度為0.005mol/L時(shí)，菌落顏色明顯的由紅色轉(zhuǎn)變成粉色；當(dāng)其濃度為0.01 mol/L時(shí)，由于抑菌作用酵母細(xì)胞生長緩慢，形成的菌落較小，但菌落顏色已經(jīng)變白，接近于酵母細(xì)胞[PSI+]的顏色；當(dāng)其濃度為0.02 mol/L時(shí)，抑菌現(xiàn)象嚴(yán)重，可以清晰地觀察到白色菌落的存在；當(dāng)其濃度達(dá)到0.05mol/L時(shí)，出現(xiàn)嚴(yán)重的抑菌現(xiàn)象，無菌落生長。這些結(jié)果表明，當(dāng)NaF濃度為0.005mol/L時(shí)，酵母細(xì)胞中的一部分ade2-1無義突變開始被抑制；當(dāng)NaF濃度為0.01 mol/L時(shí)，酵母細(xì)胞中的ade2-1無義突變大部分或者完全被抑制，出現(xiàn)酵母細(xì)胞[PSI+]表型。這種ade2-1無義突變抑制可能是由于Sup35p的聚集引起的。隨著濃度的增大，酵母細(xì)胞[PSI+]表型越來越明顯，因此，NaF對酵母細(xì)胞[PSI+]表型的誘導(dǎo)表現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系。同理，在含有0.05、0.5、0.75、1.0 mol/L NaBr的1/2YPD固體培養(yǎng)基上，當(dāng)NaBr濃度為1.0 mol/L時(shí)，出現(xiàn)酵母細(xì)胞[PSI+]的表型。

圖1 NaF、NaBr、NaI對酵母朊病毒[PSI+]表型形成的影響

不同的是，在含有0.05、0.1、0.25、0.5mol/L NaI的1/2YPD固體培養(yǎng)基上，酵母細(xì)胞[psi-]并未發(fā)生任何顏色的變化，相反，在NaI濃度0.25mol/L時(shí)，酵母細(xì)胞[PSI+]發(fā)生了明顯的顏色變化，已經(jīng)出現(xiàn)酵母細(xì)胞[psi-]表型。

在含有0.05、0.1、0.25、0.5mol/L NaI的1/2YPD培養(yǎng)基上，當(dāng)NaI濃度為0.25mol/L時(shí)，出現(xiàn)酵母細(xì)胞[psi-]的表型。

2.2免疫印跡法對酵母朊病毒[PSI+]表型形成分析結(jié)果

由圖2所示，由同一來源的基因重組酵母菌[GPSI+] 和[Gpsi-]菌落影印到含有不同濃度NaF、NaBr 1/2YPD固體培養(yǎng)基(腺嘌呤含量適中的完全培養(yǎng)基)上，隨著鹽濃度增大，[Gpsi-]菌落顏色由原來的紅色逐漸變淺，直至臨界抑菌濃度時(shí)變?yōu)榕c酵母細(xì)胞[PSI+]一致的白色。在含有0.25mol/L NaI 1/2YPD固體培養(yǎng)基上，[GPSI+]菌落顏色由最初的白色變?yōu)榧t色，與酵母細(xì)胞[psi-]一致。在添加不同濃度NaF、NaBr SD-Ade固體培養(yǎng)基(選擇性培養(yǎng)基，[psi-]菌不能生長)上，隨著鹽濃度增加，影印的[Gpsi-]菌落生長，菌落顏色為偏紅色。這些Ade+菌落可能是非常微弱的酵母細(xì)胞[PSI+]表型，即酵母細(xì)胞內(nèi)的Sup35p雖然已經(jīng)聚集，但較正常的酵母細(xì)胞[PSI+]相比，仍有大多數(shù)的Sup35p呈單體狀態(tài)，正常行使翻譯終止子的功能，導(dǎo)致無義突變不能完全被抑制，ade2-1酶部分被合成，因?qū)е乱徊糠种虚g產(chǎn)物AIR的積累并經(jīng)過轉(zhuǎn)變而產(chǎn)生紅色素。此時(shí)由于產(chǎn)生部分Sup35p聚集體，因而抑制一部分無義突變，合成ade2-1酶，進(jìn)而合成腺嘌呤以供酵母細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基上生長需要。

圖2 不同培養(yǎng)基下NaF、NaBr、NaI酵母朊病毒對[PSI+]表型形成的影響

將在含有NaF、NaBr、NaI 1/2YPD固體培養(yǎng)基上變顏色的[GPSI+]和[Gpsi-]菌落分別重新影印到不含NaF、NaBr、NaI 1/2YPD、SD-Ade固體培養(yǎng)基上。由圖2所示，在不含NaF、NaBr 1/2YPD固體培養(yǎng)基上，變白的[psi-]菌落又重新變回紅色，而在其相應(yīng)的SD-Ade固體培養(yǎng)基上，沒有類似于在含NaF、NaBr SD-Ade固體培養(yǎng)基上的菌落長出。在不含NaI 1/2YPD固體培養(yǎng)基上，變紅的[PSI+]菌落變回原來的白色，而與之對應(yīng)的SD-Ade固體培養(yǎng)基上，[PSI+]菌落變回原來的白色，并且變回的顏色比較均一，與被誘導(dǎo)的劑量無關(guān)?？梢姡徽T導(dǎo)的[PSI+]和[psi-]表型繁殖依賴于鹽的存在，當(dāng)NaF、NaBr、NaI從培養(yǎng)環(huán)境中消失時(shí)，酵母細(xì)胞[PSI+]和[psi-]表型不能夠穩(wěn)定遺傳。

綜上所述，此實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，在0.01 mol/L NaF、1.0 mol/L NaBr作用下某種程度上能形成較弱的酵母細(xì)胞[PSI+]表型，而在0.25mol/L NaI作用下，能形成酵母細(xì)胞[psi-]表型，并且這種[PSI+]和[psi-]酵母細(xì)胞表型在離開鹽環(huán)境下不能穩(wěn)定遺傳。因此，這種微弱的[PSI+]和[psi-]細(xì)胞表型是否是由酵母細(xì)胞內(nèi)的Sup35p的聚集引起，或只由其他原因的無義突變抑制引起，尚需用更為精確的半變性瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)結(jié)合免疫印跡方法，在蛋白水平上作進(jìn)一步的檢測和探討。

2.3蛋白水平分析3種鹽對酵母朊病毒[PSI+]聚集狀態(tài)結(jié)果

圖3 蛋白水平定量分析鹽作用 [PSI+]和[psi-]酵母細(xì)胞朊病毒聚集狀態(tài)

如圖3所示，SDD-AGE/Western blotting結(jié)果表明NaF、NaBr、NaI三種鹽作用[GPSI+]細(xì)胞5d后粉色菌落的聚集狀態(tài)以單體的形式存在。這表明被誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞[PSI+]表型繁殖嚴(yán)格依賴于這3種鹽的存在，當(dāng)這3種鹽從培養(yǎng)環(huán)境中消失時(shí)，酵母細(xì)胞[PSI+]表型不能穩(wěn)定遺傳，這與前期的表型實(shí)驗(yàn)和免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

3 討 論

本研究選取NaF、NaBr、NaI三種鹽，并在細(xì)胞表型和蛋白水平上探討了其對酵母朊病毒[PSI+]形成的影響。由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在NaF、NaBr、NaI各自臨界抑菌濃度下，均能在不同程度上誘導(dǎo)出[PSI+]和[psi-]細(xì)胞表型。然而，在不同培養(yǎng)基背景下，發(fā)現(xiàn)NaF、NaBr、NaI誘導(dǎo)[PSI+]和[psi-]細(xì)胞表型非常微弱，其繁殖嚴(yán)格依賴于該3種鹽存在的培養(yǎng)環(huán)境。通過SDD-AGE/Western blotting技術(shù)，可知NaF、NaBr、NaI 作用后的[PSI+]和[psi-]細(xì)胞內(nèi)，Sup35p并沒有形成聚集體，均以單體的形式存在?？梢姡琋aF、NaBr、NaI對于[PSI+]和[psi-]酵母細(xì)胞表型的形成嚴(yán)格依賴于該3種鹽存在的培養(yǎng)環(huán)境。因此，在篩選某些環(huán)境因子作用于酵母朊病毒時(shí)，要考慮不同環(huán)境因子及其最佳作用劑量的大小，并能夠使酵母朊病毒的[PSI+]表型繁殖穩(wěn)定遺傳。另外，本實(shí)驗(yàn)采用的細(xì)胞表型和蛋白水平SDD-AGE/Western blotting技術(shù)在篩選環(huán)境因子作用酵母朊病毒[PSI+]中的可行性，為使酵母朊病毒[PSI+]形成提供初級(jí)篩選方法。

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ImpactofNaF,NaBr,NaIontheFormationofYeastPrion[PSI+]

LI Hui1,ZHANG Bo1,DOU Shuang1,SONG You-tao1,2

(1.Schl.ofLifeSci.,2.Schl.ofEnvironSci.,LiaoningUni.,Shenyang110036)

In order to study the impact of NaF,NaBr,NaI on the formation of yeast prion [PSI+],the expression fusion protein GFP-Sup35p yeast prion model was used with the aid of semi-denaturing agarose gel electrophoresis combined with Western blot method to quantitatively analyse the impact of NaF,NaBr,NaI on the formation of yeast prion [PSI+] at the protein level.The results showed that in the aspect of cell phenotype,NaF,NaBr induced out yeast prion [PSI+],and the desired concentrations were at 0.02 mol/L,1.0 mol/L; NaI at concentration of 0.25mol/L can induce [PSI+] by guanidine hydrochloride cure yeast prion[psi-].At the protein level,NaF,NaBr,NaI salt after [psi-] intracellular Sup35p did not form aggregates.

yeast prion;[PSI+]; aggregation

國家自然科學(xué)基金(30970152)；遼寧省教育廳優(yōu)秀人才項(xiàng)目(2009R26)

李輝 男，實(shí)驗(yàn)師。研究方向?yàn)槔没诮湍鸽貌《镜目购Y選藥物篩選模型進(jìn)行抗酵母朊病毒藥物篩選。

E-mail: 905129549@qq.com

2013-05-17；

2013-05-21

Q93

A

1005-7021(2014)01-0012-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2014.01.003

* 通訊作者。男，教授，碩士研究生導(dǎo)師。研究方向?yàn)榧?xì)胞水平抗amyloidosis藥物篩選平臺(tái)。Tel：024-62202682，

E-mail: youtaos@gmail.com