趙月梅，高明杰

（商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛726000）

胡枝子屬部分植物的ITS序列分析

趙月梅，高明杰

（商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛726000）

利用ITS序列分析技術(shù)對胡枝子屬植物進(jìn)行了親緣關(guān)系分析，探討其遺傳多樣性及其親緣關(guān)系，試圖為胡枝子屬植物資源開發(fā)利用提供依據(jù)。將從GenBank檢索獲得的24條胡枝子屬植物（19個(gè)種）的ITS序列做系統(tǒng)發(fā)育分析，Clustal 2.0軟件進(jìn)行序列比對，Mega4.0計(jì)算序列核苷酸比例及遺傳距離，并構(gòu)建鄰接樹（Neighbor-joining tree，NJ Tree）。胡枝子的19種植物ITS序列全長為622 bp，變異位點(diǎn)占總序列的16.6%；K-2-P遺傳距離為0.001-0.085；鑒定成功率為57.9%，19種胡枝子可以聚為3支,與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果并不完全一致。

胡枝子屬；ITS序列；系統(tǒng)發(fā)育

胡枝子屬(Lespedeza） 為薔薇目豆科(Leguminosae)，目前約60個(gè)種，其野生種質(zhì)資源豐富，分布于世界各地。該屬植物用途十分廣泛：常用于水土保持和土壤改良等[1]，具有抗炎、抗過敏、鎮(zhèn)痛等藥理活性[2-3]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用為植物的遺傳結(jié)構(gòu)及物種鑒定等的研究提供了高效而可靠的辦法。高等植物的rDNA（ribosomeDNA）是由核糖體基因及與之相鄰的間隔區(qū)組成的高度重復(fù)串聯(lián)序列，其基因組序列從5’到3’依次為：外部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（external transcribed spacer,ETS）、18S rDNA、 內(nèi) 部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1（internal transcribed spacer，ITS1）、5.8S rDNA、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2）、26S rDNA和非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（non transcribed，NTS）。其中18S、5.8S和26S的基因組序列由于是編碼區(qū)，選擇壓力大，在生物種間變化小，而內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1和ITS2作為非編碼區(qū)，承受的選擇壓力較小，序列變異較大，可以提供大量的遺傳學(xué)信息[4]。因此在近緣種及易混淆的中草藥中得到了廣泛的應(yīng)用[5-8]。

系統(tǒng)分類上將胡枝子屬植物分為兩個(gè)大組：大胡枝子組（Macrolespedeza）和胡枝子組（Lespedeza）[9]。多名學(xué)者針對其分類和遺傳特性利用各種分子生物學(xué)技術(shù)標(biāo)記進(jìn)行了研究[10-12],結(jié)果表明胡枝子屬植物的種間多態(tài)性十分豐富。胡枝子屬植物中存在大量的經(jīng)濟(jì)植物及藥用植物，但是由于表型變異大，導(dǎo)致該屬植物分類上的標(biāo)準(zhǔn)比較模糊。本研究中擬對部分胡枝子屬植物進(jìn)行ITS序列測定，旨在從分子生物學(xué)水平上重建胡枝子屬植物的ITS系統(tǒng)發(fā)育樹，探討其遺傳多樣性及其親緣關(guān)系，為胡枝子屬植物種植資源開發(fā)利用和遺傳多樣性的保護(hù)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所采用的寬葉胡枝子等19種胡枝子的24條ITS序列均從genebank下載,用ClustalX 2.0軟件[13]對所有序列進(jìn)行對位排列，經(jīng)手工校正獲得目的片段。經(jīng)比對剪切后共獲得24條序列，具體信息見表1。

表1 GenBank下載序列信息

1.2 數(shù)據(jù)處理

1.2.1 序列比對

將下載好的24條ITS序列導(dǎo)入ClustalX 2.0軟件，進(jìn)行多序列對比，仔細(xì)檢查比對結(jié)果是否合理，去除序列中模糊的部分和前后長度不一致的序列，將所有序列剪切至相同長度，其中空位（gap）作丟失（miss）處理，找出所有序列中的變異位點(diǎn)。

1.2.2 計(jì)算種內(nèi)、種間的遺傳距離與進(jìn)化樹

用MEGA4.0軟 件[14]基 于K2-P (Kimura2-parameter)雙參數(shù)模型，采用NJ法（1000次重復(fù)bootstrap檢驗(yàn)各分支的支持率），將比對過的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹以便直觀鑒定物種。

1.2.3 柱形圖的構(gòu)建

判斷某段序列是否符合條形碼的標(biāo)準(zhǔn)是確定其種內(nèi)距離和種間距離之間的gap，本文用Meier等[15]的TaxonDNA軟件分別計(jì)算出每個(gè)物種的種內(nèi)距離和種間距離，并結(jié)合一般的統(tǒng)計(jì)軟件構(gòu)建出能夠體現(xiàn)種間、種內(nèi)的遺傳距離的分布頻度的柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS序列堿基組成分析

將得到的ITS序列進(jìn)行剪切，序列比對及堿基替換分析(空位Gap作缺失處理)，獲得約622 bp長度的序列，對齊比對后，發(fā)現(xiàn)該序列存在較多的變異位點(diǎn)及缺失位點(diǎn)。其中序列中T、G、A、C的平均含量分別為19.6%、31.5%、17.4%、31.5%，G+C含量為63%，變異位點(diǎn)有103個(gè)，占總序列的16.6%，有50個(gè)堿基的插入和缺失，整個(gè)ITS區(qū)的變異位點(diǎn)豐富，可以較好地區(qū)分大部分不同種質(zhì)來源的胡枝子屬植物。

2.2 ITS序列遺傳距離分析

胡枝子屬種間K2P距離分析見表2。

表2 胡枝子屬種間K2P距離

由表2可見，不同種質(zhì)來源胡枝子的K2P遺傳距離范圍為0.001-0.085。其中，綠葉胡枝子和同裂胡枝子遺傳距離最小，為0.001，表明二者親緣關(guān)系十分相近，其次是綠葉胡枝子和大葉胡枝子，二者之間遺傳距離為0.002，同裂胡枝子和短梗胡枝子之間以及長葉胡枝子與美麗胡枝子之間距離均為0.004，表明這幾對物種之間親緣關(guān)系較近，進(jìn)化時(shí)間較短。另外，截葉鐵掃帚與頭狀胡枝子之間距離最大，為0.085，表明兩者遺傳關(guān)系最遠(yuǎn)，寬葉胡枝子和頭狀胡枝子之間遺傳距離次之，為0.080，表明這兩個(gè)物種之間進(jìn)化相對獨(dú)立。

由圖1可知，ITS序列在胡枝子屬植物中的種內(nèi)種間遺傳距離分布比較符合DNA條形碼的篩選標(biāo)準(zhǔn)，即種內(nèi)距離集中在0-1.0%，在這個(gè)距離區(qū)間無種間距離分布；種間距離多集中在3.0%之后，表明種間距離足夠大。值得注意的是，在1.0%-3.0%存在二者重疊，所以還需要系統(tǒng)發(fā)生樹的證據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證ITS序列是否符合DNA條形碼的標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 胡枝子屬植物種內(nèi)、種間的遺傳距離分布頻度

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

從GenBank下載的胡枝子屬的19種胡枝子24條ITS序列做系統(tǒng)發(fā)育分析，在用Clustal2.0軟件做多重對位排列后，去除所有序列5’端和3’端的非對位排列區(qū)，最后的對位序列共包括了空位在內(nèi)的622個(gè)位置用于進(jìn)化樹構(gòu)建?；贛ega4.0軟件包的Kimura 2-paramete模式構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖2（bootStrap 1000次重復(fù),枝上數(shù)值僅顯示自展支持率＞50%）。

結(jié)果顯示，24條胡枝子屬的ITS序列分別聚為獨(dú)立的3支。其中，3條興安胡枝子序列聚在一起形成一獨(dú)立分支，與尖葉鐵掃帚（第二支）形成并系；第三支中的鐵馬鞭，截葉鐵掃帚，長葉胡枝子三個(gè)種聚為一支，親緣關(guān)系較近；此外，該支中矮生胡枝子，頭狀胡枝子，絨毛胡枝子，多花胡枝子，細(xì)梗胡枝子，中華胡枝子也均能獨(dú)立鑒定到種。第三支的剩余物種，即美麗胡枝子，同裂胡枝子，大葉胡枝子，寬葉胡枝子，短梗胡枝子，中華垂花胡枝子，展枝胡枝子，綠葉胡枝子則形成了梳子結(jié)構(gòu)，無法完全區(qū)分，美麗胡枝子的4條序列之間同源性不高，沒有完全聚在一起，而是與其他幾種混在一起。結(jié)果表明，ITS序列在胡枝子屬的這19種植物中，有8種植物是不能用系統(tǒng)發(fā)育樹不能完全鑒別的，剩余11種則可以鑒別到種。

3 結(jié)論與討論

據(jù)《中國植物志》記載,分布于中國的胡枝子屬植物共有26種,廣布于東北到長江流域至西南地區(qū),以及臺(tái)灣山地的林緣、林跡地。在20世紀(jì)初，國外已經(jīng)廣泛開展了胡枝子屬植物的引種和栽培技術(shù)研究，并取得了一系列的成果。我國對胡枝子的重視開始于20世紀(jì)80-90年代，主要集中在生物學(xué)特性、飼用價(jià)值和栽培技術(shù)等應(yīng)用性研究上，對生物遺傳學(xué)、群體遺傳學(xué)等理論基礎(chǔ)研究工作才剛剛起步。ITS區(qū)由于序列短、兩端連接高度保守區(qū)、拷貝數(shù)多、長度保守、一致進(jìn)化、進(jìn)化速率較快等，適用于被子植物科內(nèi)，尤其是近緣屬間及種間甚至居群間關(guān)系的研究。在本研究中，ITS序列存在大量的種內(nèi)種間變異和插入確實(shí)序列，并能夠從19個(gè)胡枝子屬物種中鑒別出11種，鑒定成功率為57.9%。

傳統(tǒng)的形態(tài)分類根據(jù)有無閉鎖花而將胡枝子屬植物分為兩組：無閉鎖花的為大胡枝子組，包括美麗胡枝子、展枝胡枝子、綠葉胡枝子、寬葉胡枝子等，有閉鎖花的胡枝子組包括細(xì)梗胡枝子、矮生胡枝子、尖葉胡枝子、絨毛胡枝子等。由圖2可以看出，24條胡枝子序列沒有完全按照傳統(tǒng)的分類的標(biāo)準(zhǔn)聚為兩組，而是聚成了三支。這一結(jié)果與傳統(tǒng)分類上的結(jié)果沖突，原因可能為ITS序列作為核糖體基因的一部分，只能反映該序列的進(jìn)化進(jìn)程，并不能代表整個(gè)物種的進(jìn)化歷程，所以在篩選物種的DNA條形碼時(shí)應(yīng)盡量選擇多序列聯(lián)合構(gòu)建鄰接樹，增加葉綠體和其他核糖體基因的數(shù)據(jù)，以增加鑒定上的準(zhǔn)確性。本研究發(fā)現(xiàn)4條美麗胡枝子序列鑒定比較模糊，與其他幾種如同裂胡枝子，大葉胡枝子等聚在了一起，這可能是因?yàn)檫@4條序列分布的地理距離較遠(yuǎn)，甚至出現(xiàn)了地理隔離等導(dǎo)致了遺傳距離不斷變大。

本文采用了ITS序列鑒別胡枝子屬部分植物，以確定該序列能否作為該屬植物的合適的DNA條形碼，結(jié)果表明，該序列在胡枝子屬植物的能達(dá)到57.9%的鑒定成功率，遺傳距離在種內(nèi)和種間的重疊較小，適合作為該屬植物的備選DNA條形碼，但是由于其成功率并沒有達(dá)到100%，使用時(shí)需要與更多的片段（如matK,rbcL等）聯(lián)合鑒定。

圖2 基于K2P模型的ITS2序列的NJ系統(tǒng)發(fā)生樹

[1]馬彥軍,曹致中,李 毅.胡枝子屬植物研究進(jìn)展[J].草地學(xué)報(bào),2010,27(10)：128-134.

[2]馬 翼,鄧虹珠,何 蘭,等.甘肅胡枝子屬藥用植物資源[J].中國野生植物資源,2003(6)：22-24.

[3]陳乃東,王春景,周守標(biāo).安徽胡枝子屬植物的開發(fā)研究[J].中國林副特產(chǎn),2006(1)：39-41.

[4]于華會(huì),楊志玲,楊 旭，等.藥用植物種植資源ITS序列研究進(jìn)展[J].中草藥,2010,41(3)：491-496.

[5]劉依麗,馮尚國,何仁鋒,等.基于ITS2條形碼對鐵皮石斛及其混偽品分子鑒定的初步研究[J].杭州師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2014,13(1)：36-41.

[6]劉艷玲,徐立銘,倪學(xué)明,等.基于ITS序列探討睡蓮屬植物的系統(tǒng)發(fā)育[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)：理學(xué)版,2005,51(2)：258-262.

[7]彭雪梅,張衛(wèi)明,王蔓麗,等.羅布麻及其易混品的DNA分子鑒定[J].植物研究,2007,27(3)：302.

[8]丁 平,方 琴.巴戟天與常見混偽品的rDNA ITS序列分析及其分子鑒定[J].中草藥,2005,36(6)：908.

[9]李翼云.中國植物志：41卷[M].北京：中國科技出版社, 1995.

[10]張吉宇,袁慶華,王彥榮,等.胡枝子屬植物野生居群遺傳多樣性RAPD分析[J].草地學(xué)報(bào),2006,14(3)：214-218.

[11]王秀榮,趙 楊,駢瑞琪,等.胡枝子屬植物ITS序列研究與系統(tǒng)發(fā)育分析[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào),2008,23(5)：70-73.

[12]趙 楊,陳曉陽,王秀榮,等.9種胡枝子親緣關(guān)系的ISSR分析[J].吉林林業(yè)科技,2006,35(2)：1-4.

[13]Larkin MA,Blackshields G,Brown N P，et al.Clustal Wand clustal X version 2.0[J].Bioinformatics,2007,23(21)：2947-2948.

[14]Tamura K,Dudley J,Nei M,et al.MEGA4：Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA) software version 4.0[J].Molecular Biology and Evolution,2007,24：1596-1599.

[15]Meier R,Kwong S,Vaidya G,et al.DNA barcoding and taxonomy in Diptera：a tale of high intraspecific variability and low identification success transactions[J].Systematic Biology,2006.55：715-728.

（責(zé)任編輯：李堆淑）

Analysis of ITS Sequences in Lespedeza

ZHAO Yue-mei,GAO Ming-jie
（College of Biopharmaceutical and Food Engineering,Shangluo University,Shangluo 726000,Shaanxi）

Phylogenetic analysis of ITS in Lespedeza can explore the genetic diversity and phylogenetic relationship of this genus and provide the basis for plant resource exploitation in Lespedeza.24 ITS sequences(belong to 19 species)from GenBank Accession are obtained to analysize phylogenetic relationship,Clustal 2.0 and Mega4.0 softwares were used to caculate genetic distance and build the adjacent tree(Neighbor-joining tree,NJ Tree).The length of ITS sequences was 622bp,variation sites was 16.6%of the total sequence;K-2-P genetic distance was 0.001-0.085;identification success rate was 57.9%,19 species can be clustered into three branch,which was not entirely consistent with the morphological classification.

Lespedeza;ITS sequence;phylogeny

S541.5

：A

：1674-0033（2014）06-0068-05

10.13440/j.slxy.1674-0033.2014.06.020

2014-09-21

趙月梅，女，遼寧錦州人，博士研究生，講師