黃 敏，鐘民濤

(大連醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，遼寧大連 116044)

香菇(Lentinula edodes)，是側(cè)耳科(Pleurotaccae)香菇屬的擔(dān)子菌，是全球人工種植最為普遍的食用菌［1］。近幾十年來國內(nèi)外的研究者對多種食用真菌進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)食用真菌在預(yù)防、治療惡性腫瘤方面都具有重要的藥用價值。香菇作為主要藥用真菌具有健脾開胃、解毒化痰、提高免疫、抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展等作用［2］。大量的臨床病例證明，香菇多糖制劑在間接抑制殺傷腫瘤細(xì)胞，改善癥狀體征，減輕不良反應(yīng)等方面都確實(shí)有效，因此香菇多糖制劑現(xiàn)已正式作為輔助化療藥物應(yīng)用于臨床［3-5］。然而，對香菇中蛋白質(zhì)生物學(xué)活性的研究以及從蛋白質(zhì)水平去發(fā)掘其抗腫瘤活性的本質(zhì)卻鮮有報道。我課題組多年來致力于香菇藥用價值的研究，發(fā)現(xiàn)香菇除多糖外還含有其他抗腫瘤成分:首次從多株香菇菌種中篩選得到1株香菇菌絲體的發(fā)酵液具有直接抗腫瘤、抗細(xì)菌作用［6-7］，因該菌株于1991年3月開始研究，故命名為C91-3，“C”代表“中國，China”。而后對該菌株發(fā)酵液進(jìn)行了一系列后續(xù)研究證明:香菇C91-3發(fā)酵液粗蛋白能夠直接殺死多種腫瘤細(xì)胞，大大延長荷瘤動物的生存期且顯著改善其生存狀態(tài)，并發(fā)現(xiàn)其機(jī)制與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞0凋亡有關(guān)［8-9］。目前研究熱點(diǎn)表明，尋找活性蛋白的編碼基因，克隆、表達(dá)及工業(yè)化生產(chǎn)抗新型腫瘤活性藥物顯得尤為重要。

1 香菇菌功能基因的研究現(xiàn)狀

目前，由于香菇基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的缺乏，給香菇活性蛋白從基因水平上的研究帶來了困難。雖然NCBI網(wǎng)站在2006年就已經(jīng)登記了香港大學(xué)正在進(jìn)行香菇L-54菌株的基因組的測序工作，但至今仍然沒有發(fā)布香菇基因組?；虮磉_(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tags，EST)技術(shù)被認(rèn)為是一種研究轉(zhuǎn)錄組的有效方法，已廣泛應(yīng)用于新基因發(fā)現(xiàn)、基因表達(dá)分析和蛋白質(zhì)組學(xué)［10-12］。目前香菇EST在GenBank中已有26 541條(截止4月23日，2012)，但大都沒有任何的相關(guān)功能注釋，并且這些EST數(shù)據(jù)都是通過傳統(tǒng)Sanger測序方法獲得的。盡管香港大學(xué)的Chum等［13］在2011年采用大規(guī)模cDNA的焦磷酸測序和Long-SAGE(Long Serial analysis of gene expression，SAGE)測序組合技術(shù)獲得了一些轉(zhuǎn)錄組序列，但僅限于在香菇子實(shí)體育種方面的研究，所以現(xiàn)有的數(shù)據(jù)尚不足以挖掘香菇的功能基因。

隨著基因組測序技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的微生物基因組測序工作的完成，使基因的研究速度突飛猛進(jìn)。隨著后基因組的興起，“組學(xué)”的方面研究成為日益研究的熱點(diǎn)。如轉(zhuǎn)錄組學(xué)，蛋白組學(xué)及代謝組學(xué)等。轉(zhuǎn)錄組是指特定組織或細(xì)胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，其中主要包括mRNAs，非編碼RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)和小RNA(small RNAs)。研究轉(zhuǎn)錄組對于解釋基因組的功能單位，解釋細(xì)胞和組織的分子成分，以及對于了解機(jī)體發(fā)育過程和疾病發(fā)生過程都是必要的。轉(zhuǎn)錄組研究是基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)和出發(fā)點(diǎn)，整個轉(zhuǎn)錄組分析的主要目標(biāo):對所有的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行分類;確定基因的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)，如其起始位點(diǎn)，5'和3'末端，剪接模式和其他轉(zhuǎn)錄后修飾;并量化各轉(zhuǎn)錄本在發(fā)育過程中和不同條件下(如生理/病理)表達(dá)水平的變化［14-15］。而整個轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究是以測序技術(shù)的平臺為基礎(chǔ)。Sanger測序作為第一代的DNA測序方法應(yīng)用的30多年來，對現(xiàn)代生物學(xué)研究起到了極大的促進(jìn)作用。然而隨著大規(guī)?；蚪M學(xué)的興起，多種高通量低成本的測序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，并逐步被應(yīng)用到生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域。目前，新一代測序技術(shù)(Next-generation Sequencing，NGS)核心思想是邊合成邊測序，即通過捕捉新合成的末端的標(biāo)記來確定DNA的序列，近年來已經(jīng)發(fā)展為主流的測序技術(shù)，而且有助于人們以更低廉的價格，更全面、更深入地分析基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)之間交互作用組的各項數(shù)據(jù)，這是Sanger測序無可比擬的。

2 新一代的測序技術(shù)平臺

新一代測序又稱作深度測序或高通量測序，是相對于傳統(tǒng)的Sanger測序而言，主要特點(diǎn)是測序通量高，測序時間和成本顯著下降。目前主要以Illumina公司的Solexa技術(shù)、ABI公司的SOLID技術(shù)和Roche公司的454技術(shù)為主要測序平臺。各平臺測序原理及技術(shù)特點(diǎn)比較見表1。

表1 主要高通量測序平臺的比較Table1 The comparison of major high-throughput sequencing technology

Solexa測序技術(shù)平臺是以單分子陣列原位擴(kuò)增測序技術(shù)為核心的Illumina公司Solexa基因組分析儀(Illumina Solexa Genome Analyzer)，通過Solexa高通量測序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究，可以大大降低測序所需時間和成本，并且可以獲得海量的數(shù)據(jù)，是目前使用最廣泛的新一代測序平臺，其特點(diǎn)為測序通量高;準(zhǔn)確率≥98.5%，有效地解決了多聚重復(fù)序列的讀取問題;成本低于傳統(tǒng)Sanger測序技術(shù)的1%;可以進(jìn)行Pair-end(PE)雙向測序。2008年以來，利用該技術(shù)開展的研究大幅度上升，報道文獻(xiàn)達(dá)400多篇(http://www.Illumina.com/systems/)。

Solexa測序原理是首先將細(xì)胞中的所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物反轉(zhuǎn)錄為cDNA文庫，然后將cDNA文庫中的DNA隨機(jī)剪切為小片段(或先將RNA片段化后再反轉(zhuǎn)錄)，在cDNA兩端加上接頭再利用Solexa的Genome Analyzer測序儀進(jìn)行雙末端(pairend)測序，將獲得reads進(jìn)行拼接，將拼接后最終所得序列通過比對到參考基因組獲得該細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組信息，如釀酒酵母、擬南芥等轉(zhuǎn)錄組已成功采用Solexa測序技術(shù)獲得［16-17］，并在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)了487個新轉(zhuǎn)錄本，其中有一半用芯片技術(shù)沒有鑒定出來的［18］;若無參考基因組，則進(jìn)行從頭組裝(de novo assembling)獲得的Unigene比對到各大基因及相關(guān)數(shù)據(jù)庫，根據(jù)序列同源性獲得該物種的轉(zhuǎn)錄組信息，如白粉虱轉(zhuǎn)錄組的獲得［19］。

3 香菇C91-3的轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)分析

采用Solexa高通量測序技術(shù)首先應(yīng)用到香菇C91-3轉(zhuǎn)錄組的研究中，對香菇C91-3轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序和從頭組裝(de novo)，并應(yīng)用生物信息學(xué)方法對所得序列與多個蛋白數(shù)據(jù)庫(nr、Swiss-Prot、KEGG和COG)進(jìn)行比對解析，試圖從功能基因組水平上研究香菇重要基因的表達(dá)。測序后獲得75 bp的reads數(shù)為57 998 508個，各項質(zhì)量統(tǒng)計均說明測序質(zhì)量良好。經(jīng)從有組裝組裝后獲得Unigene數(shù)為28 923條，平均長度689 bp，具有編碼框的Unigene有18 120條。另外，測序隨機(jī)性結(jié)果表示所有reads隨機(jī)的覆蓋了Unigene的從5'到3'端的全長，說明測序覆蓋度與深度良好。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)后續(xù)分析結(jié)果中GO功能分類顯示:共有2 853條Unigene分布到38個子功能分類中，可從宏觀上認(rèn)識該物種的基因功能分布特征;在COG數(shù)據(jù)庫中預(yù)測有6 203條Unigene分布于25種功能分類中;KEGG的pathway分析結(jié)果顯示，所獲得unigene分布于各種pathway中，相當(dāng)數(shù)量的功能基因同時參與到一種或幾種人類疾病與生命活動中［20］。

香菇C91-3大量的Unigene基因序列及其功能注釋信息的發(fā)現(xiàn)填補(bǔ)了香菇轉(zhuǎn)錄組的空白，并為從功能基因組水平上研究香菇活性蛋白的表達(dá)及其生物學(xué)功能的研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

4 香菇C91-3功能基因的挖掘與開發(fā)現(xiàn)狀

現(xiàn)已證實(shí)香菇C91-3菌株發(fā)酵液粗提蛋白(LFP91-3)抗腫瘤作用是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)控細(xì)胞周期有關(guān)［21］。所以以此為依據(jù)，首先篩選挖掘香菇C91-3菌株轉(zhuǎn)錄組Unigene的功能注釋中與細(xì)胞周期調(diào)控或細(xì)胞凋亡相關(guān)的功能基因，初步篩選出17個與細(xì)胞凋亡相關(guān)的功能基因的原始核苷酸序列及對應(yīng)的翻譯后的蛋白質(zhì)序列。為了形成自主的知識產(chǎn)權(quán)，將香菇轉(zhuǎn)錄組的基因命名，并已被GenBank接收，為Latcripin。源于香菇為真核生物，在真核表達(dá)系統(tǒng)中，選擇pPIC9K為表達(dá)載體，使其在畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115中進(jìn)行目的基因表達(dá)，已成功克隆出Latcripin-1(GenBank Acession Number:JQ327159)，并證實(shí)它對人肺癌細(xì)胞A549具有誘導(dǎo)凋亡作用［22］。為了優(yōu)化表達(dá)條件，為未來工業(yè)化開發(fā)生產(chǎn)抗腫瘤藥物奠定基礎(chǔ)，選擇原核表達(dá)體系，以pET-32a為表達(dá)載體，將其在宿主菌Rosetta-gami(DE3)中誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，Rosetta-gami(DE3)菌是1株可以高效表達(dá)真核源性基因的表達(dá)菌株，已成功克隆表達(dá)出6個Latcripin系列蛋白(GenBank Acession Number:KF772202、KF709447、KF682438、KF682439、KF682440、KF682441)，并鑒定出其抗腫瘤活性，同時已申報國家專利。

通過Solexa高通量新一代技術(shù)對香菇C91-3轉(zhuǎn)錄組的發(fā)現(xiàn)，為香菇C91-3的功能基因的挖掘和開發(fā)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和新策略，同時也為應(yīng)用生物技術(shù)方法獲得其他物種的活性蛋白的編碼基因提供了新的研究思路。

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