張 英，王淑敏

(1. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059; 2. 長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117)

杜仲為杜仲科落葉喬木植物杜仲Ecommia ulmoides Olliv. 的樹皮，所含綠原酸為主要成分[1]。目前，杜仲化學(xué)成分的分析方法主要有紫外可見分光光度法、高效液相色譜(HPLC)法、薄層色譜(TLC)法、紙層-紫外分光光度法等[2-4]，其中HPLC 法較常用。與HPLC 相比，毛細(xì)管電泳法具有分離速度快、分離效率高、樣品及試劑消耗量少和毛細(xì)管柱壽命長且容易清洗等優(yōu)點(diǎn)，近年來在中藥有效成分分析中逐漸得到應(yīng)用推廣[5-6]。本試驗(yàn)中建立了測定杜仲中綠原酸含量的毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)方法，并對炮制前后杜仲中綠原酸含量的變化規(guī)律進(jìn)行了系統(tǒng)研究。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Beckman Counter P/ACE MDQ Capillary Electrophoresis System高效毛細(xì)管電泳儀;彈性石英毛細(xì)管(75 μm×50 cm，河北永年光纖廠);pHS-3B 型酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)。綠原酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為110753-200212，供含量測定用);杜仲購于四川江柚藥材公司，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)王淑敏教授鑒定為Ecommia ulmoides OLliv. 的干燥樹皮;其他試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 測試條件

紫外檢測波長327 nm;分離電壓25 kV，靜壓力進(jìn)樣(高度10 cm，時間5 s);背景電解質(zhì)為30 mmol/L 硼砂緩沖溶液(用0.2 mol/L醋酸和0.1 mol/L NaOH 調(diào)pH 至9.0)，使用前超聲脫氣10 min，毛細(xì)管使用前用0.1 mol/L NaOH、水和pH=9.0 的30 mmol/L硼砂緩沖溶液各清洗10 min，每次電泳后分別用0.1 mol/L NaOH、水和pH=9.0 的30 mmol/L 硼砂緩沖溶液清洗2，3，5 min。

2.2 溶液制備

稱取綠原酸對照品0.48 mg，精密稱定，置2 mL 容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別吸取50，100，150，200，250 μL，置2 mL 容量瓶中，作為對照品溶液，使用前用0.45 μm 醋酸濾膜過濾;鹽炮制品為杜仲生品用2%(g/g)鹽水燜透后，在一定溫度下烘干所得。取杜仲生品及鹽炮制品(剪成均勻碎片)2 g，置錐形瓶中，精密稱定，加50%甲醇溶液15 mL，精密稱重，超聲30 min，超聲溫度25 ℃，用50%甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 測定條件優(yōu)化

緩沖溶液與溶液pH:考察了pH 為7.0 ～9.5 范圍內(nèi)pH 對電泳遷移的影響規(guī)律。結(jié)果表明，隨著pH 的增加，兩種分析物的遷移時間隨之增加，分辨率也增加?？赡苁怯捎陔S著pH 的增加，電滲流和分析物電泳遷移速度雖同時增加，但兩者方向相反，前者增加的程度大于后者的緣故。分別對對照品及實(shí)際樣品進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，當(dāng)pH≥9.0 時，能實(shí)現(xiàn)綠原酸的良好分離，因此確定pH=9.0 為最佳緩沖溶液的酸度。在10 ～50 mmol/L 范圍內(nèi)研究了緩沖溶液濃度對電泳分離的影響規(guī)律。結(jié)果表明，隨著緩沖溶液濃度的增加，分析物的遷移時間增加，分離度提高?？紤]到緩沖溶液濃度過高會使焦耳熱效應(yīng)明顯，造成基線噪音增加，影響檢測，故選擇30 mmol/L 的硼砂緩沖溶液。

工作電壓:在20 ～30 kV 范圍內(nèi)研究了工作電壓的影響。結(jié)果表明，在20 ～30 kV 范圍內(nèi)，兩種分析物峰高變化很小，兩種分析物的遷移時間和分辨率均隨著工作電壓的升高而降低。同時，隨著工作電壓的升高，基線噪音增加，使檢測靈敏度降低，當(dāng)工作電壓超過25 kV 后，這種影響變得明顯。綜合考慮分離度、峰高和靈敏度等因素，確定工作電壓為25 kV。

進(jìn)樣時間:在3 ～8 s 范圍內(nèi)研究了進(jìn)樣時間的影響。結(jié)果表明，隨著進(jìn)樣時間增加，分析物峰高、峰寬均增加。當(dāng)進(jìn)樣時間超過5 s 后，峰高變化減慢，但峰展寬加劇，故確定進(jìn)樣時間為5 s。

有機(jī)溶劑:考察了緩沖溶液中乙腈含量對分離的影響規(guī)律。結(jié)果表明，隨著緩沖溶液中乙腈濃度從5%到30%的增加，綠原酸的遷移時間呈增長趨勢。這主要是因?yàn)橛袡C(jī)溶劑乙腈的加入，使得電滲流降低;此外，有機(jī)溶劑的加入，提高了杜仲樣品中某些化學(xué)成分的吸收。但當(dāng)緩沖溶液中乙腈含量高于20%時，綠原酸的遷移時間達(dá)20 min 以上，對快速分析不利。因此，確定采用含有20%乙腈的緩沖溶液(即30 mmol/L 的硼砂+20%的乙腈)作為最佳分析條件。

2.3.2 線性范圍、重復(fù)性和檢出限試驗(yàn)

在上述優(yōu)化的測定條件下，綠原酸在12 min 內(nèi)能實(shí)現(xiàn)良好分離，分離的電泳圖譜見圖1。對分析物的線性關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)研究，結(jié)果表明，綠原酸質(zhì)量濃度在0.06 ～0.30 g/L 范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，線性回歸方程為 Y=84 795 X+689.3(r=0.999 4)。還對方法重復(fù)性進(jìn)行了考察，結(jié)果綠原酸遷移時間和峰面積的RSD 分別為1.91%和2.30%(n=5)。利用3 倍噪音法，測得綠原酸的檢出限為0.015 g/L。

2.3.3 加樣回收試驗(yàn)

取杜仲生品適量，精密稱定，準(zhǔn)確加入一定量的綠原酸對照品，按供試品溶液制備待測溶液，依法進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1，表明該方法用于杜仲的測定是準(zhǔn)確、可靠的。

表1 綠原酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.4 樣品測定

利用所建立的方法，分析了杜仲生品和炮制品中綠原酸含量的變化情況，電泳圖譜見圖1B 和圖1C。結(jié)果杜仲生品和炮制品中綠原酸含量分別為0.118%和0.130%(n=3)?？梢?，杜仲經(jīng)鹽水炮制后綠原酸含量增加了10.17%，這從化學(xué)成分方面對杜仲炮制后入藥進(jìn)行了科學(xué)的解釋。

圖1 毛細(xì)管區(qū)帶電泳圖

3 討論

通過優(yōu)化分離條件，建立了分析杜仲中綠原酸的毛細(xì)管區(qū)帶電泳法，即電泳緩沖液為pH =9.0 的30 mmol /L 硼砂溶液加入20%乙腈的溶液，分離電壓為25 kV，進(jìn)樣時間為5 s。實(shí)際樣品分析及加樣回收試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法快速、準(zhǔn)確、可靠，為杜仲藥材和含有杜仲藥材的藥物的質(zhì)量控制提供了有效的的分析方法。

利用所建立的方法對炮制前后杜仲中綠原酸含量進(jìn)行分析，結(jié)果表明，杜仲經(jīng)炮制后綠原酸含量明顯增加，說明在炮制過程中杜仲的主要有效化學(xué)成分含量發(fā)生了變化。因此，杜仲炮制對其臨床應(yīng)用具有重要意義。

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(一部)[M]. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:365.

[2] 劉 慧，張 盛，劉仲華. HPLC 法同時測定杜仲皮中京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷和松脂醇二葡萄糖苷[J]. 中草藥，2012，43(8):1 547 -1 549.

[3] 孫利偉，趙 輝，蔡楠楠. 正交試驗(yàn)優(yōu)選杜仲中綠原酸的提取工藝[J]. 中國藥業(yè)，2011，20(18):41 -43.

[4] 田 吉，何 兵，李春紅.HPLC 法同時測定杜仲葉中綠原酸和蘆丁含量[J]. 瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，33(5):490 -493.

[5] 張奉蘇，陳 菲，傅興圣，等. 高效毛細(xì)管電泳法同時測定牛樟芝中5 種核苷類成分的含量[J]. 中國藥學(xué)雜志，2013，48(12):1 080-1 021.

[6] 方艷夕，葉維靜，毛斌斌，等. 白頭翁中糖類組分的毛細(xì)管電泳-安培檢測研究[J]. 中成藥，2013，35(7):151 -155.