劉常姝，李 紅，崔云前，* ，王吉龍

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250353;2.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015;3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271018）

飲用啤酒能夠引起血液中尿酸含量上升，從而引發(fā)高尿酸血癥及痛風(fēng)，通過(guò)降低啤酒中的嘌呤含量有效避免這一現(xiàn)象［1－2］。目前有關(guān)低嘌呤啤酒的研究，常見(jiàn)方法有高比例輔料法、高濃發(fā)酵法和吸附法［3－7］。這些方法在低嘌呤啤酒的實(shí)際生產(chǎn)中仍面臨諸多問(wèn)題，如高比例輔料法降低啤酒嘌呤物質(zhì)含量的程度有限，而吸附法會(huì)引起啤酒風(fēng)味損失［8］。因此，開(kāi)辟新的嘌呤減少途徑對(duì)低嘌呤啤酒的生產(chǎn)有重要意義。

啤酒中的嘌呤主要來(lái)自麥芽，麥芽中的嘌呤溶于麥汁中［9－10］。研究表明，酵母能夠吸收培養(yǎng)液中嘌呤物質(zhì)，用于維持自身的生長(zhǎng)代謝與繁殖［11－12］。經(jīng)酵母發(fā)酵后，發(fā)酵液殘留嘌呤，尤其是鳥(niǎo)嘌呤和腺嘌呤的含量明顯降低［13］，證明酵母吸收確實(shí)是可以降低啤酒嘌呤含量的有效途徑。因此，研究酵母對(duì)嘌呤物質(zhì)的吸收規(guī)律，能夠更科學(xué)、更高效地利用酵母吸收嘌呤物質(zhì)，從而降低啤酒嘌呤含量。

培養(yǎng)液中嘌呤有游離嘌呤和非游離嘌呤兩種存在形式，非游離嘌呤幾乎全部是以嘌呤核苷的形式存在［14－15］。水解核苷能夠顯著增加游離嘌呤的含量。嘌呤核苷酶能夠使核苷中非游離態(tài)嘌呤轉(zhuǎn)化成游離態(tài)［16］。麥芽自身含有的嘌呤核苷酶酶活非常低［17－19］，市面常見(jiàn)的嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）產(chǎn)品酶活相對(duì)較高，更適用于增加游離嘌呤含量。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)核酸水解酶的研究較多，但研究所得的目的產(chǎn)物均為核苷酸［20－21］，對(duì)水解核苷的嘌呤核苷酶的研究較少［22－24］，國(guó)內(nèi)尚未有該方面研究。Shibano Y 等人從人蒼白桿菌（Ochrobactrum anthropi）中提取了嘌呤核苷酶并用于生產(chǎn)低嘌呤啤酒，取得了一定成果［15］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

YPD液體培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品HPLC 99%，美國(guó)Sigma公司;鳥(niǎo)苷、腺苷、肌苷、黃苷標(biāo)準(zhǔn)品 99%，北京索萊寶科技有限公司;嘌呤核苷磷酸化酶8.78U/mg，500U 北京世紀(jì)山水科技有限公司。

高效液相色譜儀 配有紫外檢測(cè)器和CLASS－VP工作站，日本島津;pH計(jì)PHS－3C 上海精密科學(xué)儀器有限公司;分析天平Tecator－6002 Switzerland公司;恒溫水浴鍋HX105 長(zhǎng)流科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酵母吸收嘌呤實(shí)驗(yàn) 向YPD液體培養(yǎng)基中分別添加不同含量的嘌呤及嘌呤核苷標(biāo)準(zhǔn)品，制得多組嘌呤含量不同的酵母培養(yǎng)液。其中，5組游離嘌呤與總嘌呤（游離與非游離嘌呤總和）含量均不相同的培養(yǎng)液用于研究酵母對(duì)不同形式嘌呤化合物吸收規(guī)律，記為培養(yǎng)液1、2、3、4、5;10 組游離嘌呤含量依次升高，總嘌呤含量相同的培養(yǎng)液用于研究麥汁嘌呤游離率對(duì)酵母的嘌呤吸收率的影響，記為W1～W10。取300mL培養(yǎng)液分裝至500mL三角瓶。無(wú)菌環(huán)境下接種適量酵母，發(fā)酵溫度控制在12±0.2℃，24h內(nèi)每4h搖動(dòng)一次，24h后加發(fā)酵栓，發(fā)酵7d，檢測(cè)發(fā)酵液的游離嘌呤及總嘌呤含量。每組實(shí)驗(yàn)做三個(gè)平行。

1.2.2 PNP反應(yīng)體系與反應(yīng)條件實(shí)驗(yàn) 酶液配制:分別稱(chēng)取 0.0200、0.0400、0.0800g PNP 酶，用 pH7.0磷酸鉀緩沖液定容至10mL，配制成2、4、8mg/mL的酶液A、酶液B、酶液C，4℃保存待用。PNP反應(yīng)實(shí)驗(yàn):取4 支試管，各加 5mL 麥汁，編號(hào) 0、1、2、3，分別加入100μL磷酸鉀緩沖液、酶液A、酶液B、酶液C，30℃反應(yīng)10min。煮沸2min終止反應(yīng)，冷卻后，檢測(cè)反應(yīng)液的游離嘌呤及總嘌呤;另取3支試管，反應(yīng)體系與反應(yīng)溫度同上，反應(yīng)時(shí)間分別為10、30、60min。上述實(shí)驗(yàn)均做三次平行。

1.2.3 樣品處理方法 參考文獻(xiàn)［25］，游離嘌呤檢測(cè)樣品:取1mL樣品，經(jīng)0.45μm膜過(guò)濾，直接進(jìn)樣檢測(cè);總嘌呤檢測(cè)樣品:樣品超聲5min除氣，取2mL于10mL比色管，加入 2mL 3mol/L硫酸溶液，100℃水解5min，冰浴冷卻，加入4mL 3mol/L NaOH中和，用超純水定容至10mL，經(jīng)0.45μm膜過(guò)濾后進(jìn)樣。

1.2.4 液相色譜條件 參考文獻(xiàn)［26－27］，色譜柱:Thermo Hypersil GOLD AQ（4.6mm × 250，5μm）;柱溫:25℃;流 動(dòng) 相:0.02mol/LKH2PO4緩 沖 液（pH4.00）;流速1mL/min;進(jìn)樣量:10μL;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):254nm。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 為了研究方便，本文中提出了兩個(gè)概念。一是嘌呤游離率，其定義為培養(yǎng)液游離嘌呤含量與總嘌呤含量的百分比，表示嘌呤的游離程度;二是酵母的嘌呤吸收率，其定義為被酵母吸收的嘌呤量與培養(yǎng)液游離嘌呤含量的比值，用來(lái)表示酵母對(duì)嘌呤的吸收能力。二者的計(jì)算公式分別為:

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母對(duì)嘌呤類(lèi)化合物吸收規(guī)律的研究

2.1.1 酵母對(duì)不同形式嘌呤化合物吸收規(guī)律的研究5組嘌呤含量各不相同的培養(yǎng)液發(fā)酵前（BF）與發(fā)酵后（AF）游離鳥(niǎo)嘌呤（FG）、游離次黃嘌呤（FH）、游離黃嘌呤（FX）、游離腺嘌呤（FA）以及總游離嘌呤（TFG）含量見(jiàn)表1，麥汁發(fā)酵前后非游離鳥(niǎo)嘌呤（NFG）、非游離次黃嘌呤（NFH）、非游離黃嘌呤（NFX）、非游離腺嘌呤（NFA）以及總非游離嘌呤（TNFP）含量見(jiàn)表2。

由表1可以看出，5種嘌呤含量的培養(yǎng)液經(jīng)過(guò)發(fā)酵后，各種游離嘌呤含量明顯低于發(fā)酵前。對(duì)表中數(shù)據(jù)分析可知，發(fā)酵前后非游離的鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤、腺嘌呤以及總嘌呤含量均呈顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為 0.985、0.985、0.989、0.935、0.985（p＜0.05）;發(fā)酵前后游離態(tài)的鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤以及總嘌呤的均值差值分別為13.58、1.88、1.44、16.86和33.86mg/L（p＜0.05），說(shuō)明發(fā)酵前游離嘌呤的含量高于發(fā)酵后，差異顯著。由此可以證明，酵母能夠吸收利用游離嘌呤。

另外，由表1還可看出發(fā)酵后仍有少量游離嘌呤存在，可見(jiàn)酵母無(wú)法完全利用培養(yǎng)液中的游離嘌呤。

由表2可以看出，5種嘌呤含量的培養(yǎng)液經(jīng)過(guò)發(fā)酵后，各種非游離嘌呤含量與發(fā)酵前相比基本無(wú)變化。

經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)分析可知，發(fā)酵前后非游離的鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤、腺嘌呤以及總嘌呤含量均呈顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.999（p＜0.01）、0.993（p＜0.01）、0.983（p＜0.01）、0.998（p＜0.01）、0.999（p＜0.01）;上述非游離嘌呤對(duì)應(yīng)的均值差值分別為0.66、－0.12、－0.10、0.04 和 0.52mg/L（p＞0.05），說(shuō)明發(fā)酵前后非游離嘌呤的含量均無(wú)顯著差異。由此可以證明，發(fā)酵過(guò)程中非游離嘌呤含量不發(fā)生變化，即酵母不能吸收利用非游離嘌呤。個(gè)別檢測(cè)值為負(fù)是由液相檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性導(dǎo)致的誤差。

綜上可知，酵母能且只能吸收游離形態(tài)的嘌呤，但不能將游離嘌呤完全吸收。因此，研究酵母對(duì)培養(yǎng)液嘌呤的吸收規(guī)律，即研究酵母對(duì)培養(yǎng)液中游離嘌呤的吸收規(guī)律。

2.1.2 培養(yǎng)液嘌呤游離率對(duì)酵母的嘌呤吸收率的影響 W1～W10十種不同培養(yǎng)液的鳥(niǎo)嘌呤（G）、次黃嘌呤（H）、黃嘌呤（X）、腺嘌呤（A）和總嘌呤（TP）的游離率見(jiàn)圖1，酵母對(duì)各嘌呤的吸收量以及吸收率分別見(jiàn)圖2和圖3。

表1 培養(yǎng)液發(fā)酵前后游離態(tài)嘌呤含量Table 1 The content of free purines of 5 worts before and after fermentation

表2 培養(yǎng)液發(fā)酵前后非游離態(tài)嘌呤含量Table 2 The content of non－free purines of 5 worts before and after fermentation

圖1 10組不同培養(yǎng)液的嘌呤游離率Fig.1 The purine dissociation rate of 10 different worts

圖2 酵母對(duì)10組不同培養(yǎng)液的嘌呤吸收量Fig.2 The purine absorption of 10 different worts

由圖1和圖2可以看出，隨著培養(yǎng)液中嘌呤游離程度的增加，酵母對(duì)各種嘌呤的吸收量升高。酵母的嘌呤吸收量與培養(yǎng)液的嘌呤游離率之間相關(guān)性顯著（鳥(niǎo)嘌呤R2＞0.990，p＜0.01;次黃嘌呤R2＞0.991，p＜0.01;黃嘌呤R2＞0.998，p＜0.01;腺嘌呤R2＞0.996，p＜0.01;總嘌呤R2＞0.995，p＜0.01）。由于酵母從胞外吸收游離嘌呤的主要途徑是主動(dòng)運(yùn)輸，當(dāng)培養(yǎng)液中總嘌呤含量一定時(shí)，嘌呤游離率越高，游離嘌呤含量越高，與酵母細(xì)胞膜上載體結(jié)合概率越大，酵母越容易從外部獲得嘌呤，因此導(dǎo)致酵母對(duì)各種嘌呤的吸收量升高。

圖3 酵母對(duì)10組不同培養(yǎng)液的嘌呤吸收率Fig.3 The purine absorption rate of 10 different worts

另外，酵母吸收 G、H、X、A、TP增加量與培養(yǎng)液中對(duì)應(yīng)嘌呤增加量的均值差值分別為－1.12（p＞0.05）、－0.04（p＞0.05）、－0.15（p＞0.05）、－0.16（p＞0.05）、－1.14（p＞0.05），即酵母吸收嘌呤的增加量均低于相應(yīng)嘌呤在培養(yǎng)液中的增加量。說(shuō)明培養(yǎng)液中增加的游離嘌呤無(wú)法被酵母完全吸收。

由圖1和圖3可以看出，隨著培養(yǎng)液中嘌呤游離程度的增加，酵母對(duì)各種嘌呤的吸收率變化并不一致。總的來(lái)說(shuō)，當(dāng)嘌呤游離率小于90%時(shí)，隨著培養(yǎng)液中嘌呤程度的增加，酵母對(duì)游離嘌呤的整體吸收率基本不變;當(dāng)嘌呤游離率大于90%時(shí)，酵母對(duì)嘌呤的吸收率略有降低。

其中，對(duì)于培養(yǎng)液中的次黃嘌呤、黃嘌呤，隨著培養(yǎng)液中嘌呤游離程度的增加，其吸收率均呈升高趨勢(shì)。說(shuō)明酵母吸收嘌呤的增加速度大于培養(yǎng)液游離嘌呤的增加速度。在游離次黃嘌呤、游離黃嘌呤含量較低的條件下，其含量變化對(duì)酵母吸收這兩種嘌呤的影響極大，酵母吸收嘌呤的能力呈非線(xiàn)性增長(zhǎng)，從而引起吸收率增高的現(xiàn)象。

對(duì)于G、A，當(dāng)嘌呤游離率小于90%時(shí)，隨著培養(yǎng)液中嘌呤程度的增加，酵母對(duì)這兩種嘌呤的吸收率基本不變;當(dāng)嘌呤游離率大于90%時(shí)，吸收率明顯降低。這是因?yàn)榕囵B(yǎng)液中這兩種嘌呤整體含量水平較高，而酵母對(duì)游離嘌呤的吸收能力有一定限度，當(dāng)培養(yǎng)液中G、A含量過(guò)高時(shí)（G＞19.8±0.5mg/L，A＞20.1±0.4mg/L），酵母不能充分利用多出來(lái)的游離嘌呤，因此，酵母對(duì)這兩種游離嘌呤的吸收率反而降低，這與酵母在該條件下嘌呤吸收量升高并不矛盾。

綜上可知，當(dāng)嘌呤含量極低時(shí)，酵母對(duì)嘌呤的吸收率隨嘌呤游離率的增加而增加;當(dāng)嘌呤含量適中時(shí)，酵母對(duì)嘌呤的吸收率維持在一定水平，不隨嘌呤游離率的增加而改變;當(dāng)嘌呤含量過(guò)高時(shí)，隨著嘌呤游離率的增加，酵母的嘌呤吸收率逐漸下降。

另外，由圖3還可看出，其中腺嘌呤的吸收率始終是四種嘌呤中最高的，基本維持在100%。其次是次黃嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤和黃嘌呤。

上述結(jié)論表明，增加培養(yǎng)液中游離嘌呤比例，能夠有效增加酵母對(duì)游離嘌呤的吸收量，從而減少啤酒中的嘌呤含量。

2.2 PNP對(duì)麥汁嘌呤的影響

為了研究PNP對(duì)麥汁嘌呤含量的影響，本文以麥汁為底物，添加適量PNP酶制劑進(jìn)行反應(yīng)。

2.2.1 PNP添加量對(duì)麥汁中游離嘌呤的影響 向一定量麥汁中添加不同含量的PNP酶，檢測(cè)添加后麥汁嘌呤變化。不同PNP酶添加量麥汁中嘌呤游離率見(jiàn)圖4。

圖4 PNP添加量對(duì)4種嘌呤游離率的影響Fig.4 The effect of PNP addition on 4 kinds purine dissociation rate

由圖4可以看出，隨著PNP添加量的增加，麥汁中整體游離嘌呤含量呈明顯的增加趨勢(shì)。其中，當(dāng)酶添加量由0U增加至0.7U時(shí)，總游離嘌呤含量增加了28.5±0.6%。其中，麥汁中FG、FH、FX含量分別增加了59.8±0.1%、117.9±2.6%和增加了33.7±0.2%，但FA含量降低了12.0±0.2%。說(shuō)明PNP在本實(shí)驗(yàn)條件下，水解腺苷糖苷鍵的反應(yīng)為逆向反應(yīng)，即反應(yīng)向著游離嘌呤和核糖生成腺苷的方向進(jìn)行。

麥汁中的嘌呤未能完全游離出來(lái)。這是由于PNP催化反應(yīng)是可逆反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)條件下已達(dá)到平衡狀態(tài)。另外，由于PNP是以核苷為底物，不能分解麥汁中核苷酸等含嘌呤的化合物，因此結(jié)束后仍存有少量的聚合態(tài)嘌呤。

上述結(jié)論表明，PNP酶能夠水解麥汁中核苷的糖苷鍵，使麥汁中游離嘌呤含量明顯增高。只是由于PNP反應(yīng)底物以及反應(yīng)自身特點(diǎn)的限制，若要提高PNP對(duì)麥汁核苷的水解效果，還需進(jìn)一步的研究。

2.2.2 嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）催化反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間對(duì)麥汁中游離嘌呤含量的影響 不同反應(yīng)時(shí)間，麥汁中游離嘌呤含量及總嘌呤含量見(jiàn)圖5。

圖5 PNP反應(yīng)時(shí)間對(duì)4種嘌呤游離率的影響Fig.5 The effect of PNP reaction time on 4 kinds of purine dissociation rate

由圖5可以看出，反應(yīng)10min后麥汁中游離嘌呤含量基本不變。說(shuō)明PNP催化反應(yīng)十分迅速，反應(yīng)10min基本達(dá)到平衡。相對(duì)于麥汁制備過(guò)程所需時(shí)間（2～4h），PNP反應(yīng)快速，具有對(duì)工藝時(shí)間影響較小的優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，酵母只能夠吸收麥汁中游離形式的嘌呤，且隨著麥汁中嘌呤游離率的增加，酵母吸收的嘌呤含量也隨之增高。因此，通過(guò)酵母吸收的形式降低啤酒嘌呤，關(guān)鍵在于增加麥汁的嘌呤游離率。同時(shí)證實(shí)，PNP對(duì)麥汁中的核苷確實(shí)有明顯的水解效果，能夠增加麥汁的嘌呤游離率;且PNP催化反應(yīng)時(shí)間較快，對(duì)麥汁的生產(chǎn)工藝影響較小。上述結(jié)論對(duì)于低嘌呤啤酒的生產(chǎn)具有一定指導(dǎo)意義及參考價(jià)值。同時(shí)，PNP酶在本實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)核苷的水解能力有限，還需進(jìn)一步提高PNP的水解能力。

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