·論著·

阿托伐他汀對兔動脈粥樣硬化斑塊中VEGF干預作用的研究

馬 曄，關瑞錦，馬建芳

目的 探討阿托伐他汀對實驗兔動脈粥樣硬化模型血脂、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)水平及動脈粥樣斑塊內(nèi)VEGF蛋白水平的影響。方法 20只新西蘭大白兔，隨機分為對照組5只，高脂組15只；高脂組喂養(yǎng)4 w，用球囊損傷腹主動脈后，隨機分為模型組、低劑量他汀組、高劑量他汀組，每組各5只，共飼養(yǎng)12 w。ELISA檢測各組血清TG、TC、LDL-C、VEGF；12 w末檢測動脈粥樣斑塊內(nèi)VEGF蛋白定量及VEGF mRNA水平。結果 與對照組相比，模型組、他汀組6 w和12 w血清LDL-C、TG、TC和VEGF均顯著增高(P<0.01)；與模型組比較，他汀組血脂和血清VEGF明顯降低(P<0.05)；與低劑量他汀組比較，高劑量他汀組血脂和血清VEGF明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，他汀組動脈粥樣硬化斑塊中VEGF蛋白水平下調(diào)，但高劑量他汀組顯著降低動脈粥樣硬化斑塊中VEGF的表達(P<0.05)。結論 兔動脈粥樣硬化模型血清VEGF水平及動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)VEGF高表達，阿托伐他汀可下調(diào)AS斑塊內(nèi)VEGF的表達水平。

動脈粥樣硬化；血管內(nèi)皮生長因子；阿托伐他汀；兔

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種由多種炎癥細胞和炎癥介質(zhì)參與的慢性疾病，炎癥微環(huán)境對血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達有顯著影響，并與炎癥細胞共同參與炎癥過程[1-2]。新生血管是AS斑塊發(fā)展進程中的重要伴隨現(xiàn)象，VEGF作為新生血管形成的中樞調(diào)節(jié)因子，對其分化成熟及血管形成起著重要的調(diào)控作用。本研究通過動物實驗觀察AS斑塊內(nèi)VEGF的表達及阿托伐他汀對其干預作用的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性新西蘭大白兔20只，2～3月齡，體重約1.3～2.1 k g，清潔級，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。飼養(yǎng)許可證SYXK(軍)2007-031。室溫18～22 ℃，濕度(50±10)%。

1.2 主要儀器、試劑盒和藥品 兔TC、TG、LDL-C和VEGF ELISA試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司)；Biozol Reagent、RNase free ddH2O[BIOER(杭州)]；多聚賴氨酸Sigma；VEGF一抗(武漢基因美)；羊抗兔二抗(invitrogen)(中杉金橋)；BIOZOL總RNA提取試劑、BioRT cDNA 第一鏈合成試劑盒、BioEasy SYBR Green I 熒光PCR試劑盒(杭州博日)；HM315R切片機(德國)；PCR儀(ABi美國)；生物顯微鏡(Nikon Eclipse 55I,彩色數(shù)字CCD)；阿托伐他汀鈣片(輝瑞公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組 20只新西蘭雄性大白兔，隨機分對照組5只(普通飼料，每只100 g/d)、高脂組15只(高脂飼料，每只100 g/d)。高脂組喂養(yǎng)4 w，用球囊損傷腹主動脈后隨機分為模型組5只(高脂飼料)、高劑量他汀組5只[高脂飼料+阿托伐他汀10 mg/(kg·d)]；低劑量他汀組5只[高脂飼料+阿托伐他汀5 mg/(kg·d)]。藥物干預組阿托伐他汀片水溶后灌胃，1次/d，模型組以等劑量生理鹽水灌胃，飼養(yǎng)12 w。高脂飼料配方：普通飼料84%+10%蛋黃粉+1%膽固醇+5%豬油。

1.3.2 血清TG、TC、LDL-C、HDL-C和VEGF測定 分別在0、6、12 w于兔耳緣靜脈采血5 ml，采血前禁食12 h，離心后提取血清，用ELISA法檢測血清TG、TC、LDL-C、VEGF水平。具體操作按說明書。

1.3.3 Western blotting檢測VEGF蛋白含量 12 w后空氣栓塞處死實驗兔并剪取腹主動脈，提取組織蛋白質(zhì)并制備SDS-PAGE 凝膠，樣品變性后電泳，經(jīng)凝膠轉膜、一抗封閉、洗膜、二抗封閉再洗膜，美國UVP分析儀對膠片進行掃描，系統(tǒng)自動生成灰度值，即為結果。

1.3.4 熒光定量PCR檢測VEGF mRNA的表達 血管組織抽提RNA后保存于-70 ℃；在Applied Biosystems 7500 Fast熒光定量PCR儀上進行PCR反應；PCR反應 92 ℃ 10 min，(92 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min)40個循環(huán)，4 ℃保存。GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ddCt法對目的基因進行相對定量。引物信息：VEGF正向引物5′CGATCGAGACCTTGGTGGACAT 3′,反向引物5′TGCATGGTGACGTTGAACTCCT 3′；GAPDH正向引物5′ACCCATCACCATCTTCCAGGAG 3′,反向引物5′GAAGGGGCGGAGATGATGAC3′。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用PEMS 3.1統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示。多組間均數(shù)比較采用t檢驗，組間兩兩比較采用SNK檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組兔不同時間點血脂和VEGF水平 分別于第0、6和12 w檢測不同組兔血LDL-C、TG、TC和VEGF水平。與對照組相比，模型組、低劑量他汀組、高劑量他汀組在6和12 w的血LDL-C、TG、TC、VEGF均顯著增高(P<0.01)；與模型組比較，他汀組血LDL-C、TG、TC、VEGF在第6 w和12 w有明顯降低，但高劑量他汀組降低更為明顯(P<0.05)。見表1。

2.2 各組兔動脈血管內(nèi)膜病理學改變 HE染色后對照組動脈內(nèi)皮完整，無脂質(zhì)沉積。模型組內(nèi)皮增生、增厚，管腔明顯變窄，有大量泡沫細胞和脂質(zhì)沉積，中膜變薄。他汀藥物干預組血管內(nèi)膜不同程度增厚和泡沫細胞形成。見圖1。

2.3 各組兔AS斑塊內(nèi)VEGF蛋白表達 與對照組比較，模型組AS斑塊中VEGF的表達顯著增高(P<0.01)。與模型組比較，阿托伐他汀干預組均能降低VEGF在AS斑塊中的表達，但高劑量阿托伐他汀組較低劑量阿托伐他汀組能進一步降低兔AS斑塊中VEGF的表達(P<0.05，表2)。

2.4 各組兔AS斑塊內(nèi)VEGF mRNA的表達 與對照組比較，模型組及他汀組VEGF mRNA的表達水平更為顯著(P<0.01)。與模型組比較，他汀藥物組能降低兔AS斑塊VEGF mRNA的表達水平(P<0.05)。與低劑量阿托伐他汀組比較，高劑量組能降低VEGF mRNA的表達(P<0.05)。

表1 不同時間點各組兔血脂及VEGF水平(n=5)

注： 與同時間對照組比較，①P<0.01；與同時間模型組比較，②P<0.05；與同時間低劑量阿托伐他汀組比較，③P<0.05；與本組0 w比較，④P<0.01；與本組6 w比較，⑤P<0.05

對照組

模型組

低劑量阿托伐他汀組

高劑量阿托伐他汀組

組別VEGF/β?actinVEGFmRNA/GAPDH對照組0．24±0．000．95±0．07模型組0．78±0．02①2．80±0．24①低劑量他汀組0．55±0．02①②1．91±0．26①②高劑量他汀組0．42±0．03①②1．44±0．02①②③

注：與對照組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.05； 與低劑量阿托伐他汀組比較，③P<0.05

3 討論

血脂異常是AS發(fā)生發(fā)展的重要因素，本研究表明，高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合球囊損傷組兔在第6 w和12 w時血清TG、LDL-C、TC水平逐漸顯著增高。其腹主動脈HE染色可見典型的AS改變，此結果與國內(nèi)相關研究結果一致[3]。

本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合球囊損傷血管內(nèi)皮致血管通透性的增加，進一步導致大量脂質(zhì)沉積血管內(nèi)膜下，觸發(fā)LDL成OX-LDL。同時在多種炎性因子的共同作用下，促進AS斑塊中VEGF的表達上調(diào)[4]。VEGF是一種與血管增殖密切相關的多肽生長因子，是最直接的血管內(nèi)皮細胞促分裂素。血管內(nèi)皮細胞是VEGF發(fā)揮作用的主要靶器官，研究表明其在體內(nèi)外均具有促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移、出牙及血管腔形成等功能[5]。同時，VEGF作為血管生成旁分泌刺激因子，其表達受多種途徑信號通路的調(diào)節(jié)，細胞因子等對VEGF的表達也起調(diào)控作用，而且，外源性VEGF可促進AS斑塊形成[6]。

本研究顯示，10 mg/(kg·d)和5 mg/(kg·d)阿托伐他汀組較模型組血清TG、LDL-C、TG水平顯著降低，動脈粥樣硬化病變程度較輕。同時10 mg/(kg·d)能更有效降低AS斑塊內(nèi)VEGF mRNA水平。多項研究表明，負荷劑量的阿托伐他汀在降脂、穩(wěn)定粥樣斑塊、抗炎方面優(yōu)于常規(guī)劑量，能明顯減少心血管事件，并具有劑量依賴關系[7-9]。阿托伐他汀通過優(yōu)化血管內(nèi)皮，降低VEGF及相關蛋白的表達，延緩甚至逆轉AS的進展。因此，阿托伐他汀可以減少斑塊內(nèi)血管生成，達到穩(wěn)定斑塊的作用[10]。ARMYDA-ACS研究，正是基于充分應用他汀類藥物的調(diào)脂外作用的基本理論并獲得明顯效果。

阿托伐他汀在發(fā)揮降脂作用之外，還可降低兔AS模型血清VEGF水平，抑制AS斑塊內(nèi)VEGF mRNA的表達。因此，可以推測阿托伐他汀通過下調(diào)動脈粥樣斑塊內(nèi)VEGF的表達，從而抑制新生血管形成途徑達到穩(wěn)定AS斑塊的作用。

[1] Akeson A,Herman a,Winginton D,et al.Endothelial cell activation in a VEGF-A gadient:relevance to cell fate decisions[J].Microvascular Research,2010,80(1):65-74.

[2] Libby P,Ridker PM,Hansson GK.Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis[J].Nature,2011,473(7347):317-325.

[3] 王園園,尤民惠,周磊磊,等.兔動脈動脈粥樣硬化模型的建立和評價[J].實驗動物學,2008,25(3):18-20.

[4] Neuhaus T,Lutz C,Stier S,et al.The use of suppression subtractive hybridization for the study of SDF-1a induced gene expression in human endothelial cells[J].Mol Cell Probes,2003,17(39):245-252.

[5] 蔣雷,陳燕凌,余菲菲,等.膽囊癌組織中血管內(nèi)皮生長因子C和D的表達及其與淋巴管和血管生成的關系 [J].中華腫瘤雜志,2010,32(3):190-195.

[6] 肖敏,王瑋,黨書毅,等.血管內(nèi)皮生長因子165對實驗性兔動脈粥樣硬化斑塊形成的影響[J].中國動脈硬化雜志,2000,8(2):11-18.

[7] 李建勇,胡大一,史旭波,等,不同劑量阿托伐他汀對冠心病患者的療效和安全性多中心研究[J].中華心血管病雜志,2005,33(12):1085-1087.

[8] 劉廣安,劉峰,陳潤祥,等.負荷劑量阿托伐他汀降低冠狀動脈介入圍手術期心血管事件作用和機制的探討[J].實用臨床醫(yī)藥雜志,2011,15(9):22-28.

[9] 張曉娟,李保,王敬萍,等.不同劑量阿托伐他汀對冠脈介入治療吸納后炎癥因子的影響[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志,2010,8(7):791-792.

[10] 張燕,夏豪,聶小磊.阿托伐他汀對大鼠動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊內(nèi)新生血管的影響[J].心臟雜志,2010,22(5):654-657.

Effects of atorvastatin on VEGF in atherosclerotic plaque in rabbits

Ma Ye1,Guan Ruijin2,Ma Jianfang1

1.Department of Geriatrics,Hospital 476 of Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command,Fuzhou,Fujiang,350002,China;2.Department of Cardiology,Fujian Provincial Hospital,Fuzhou,Fujiang,350002,China

Objective To study the effects of atorvastatin on serum lipid and vascular endothelial growth factor(VEGF)and its effects on VEGF in atherosclerotic plaque in rabbit model.Methods 20 New Zealand rabbits were randomly divided into 2 groups:control group(n=5)and hyper-cholesterol group(n=15).The rabbits in hyper-cholesterol group were fed with hyper-cholesterol diet for 4 weeks and then catheter-induced abdominal aorta injury was made to them;then the 15 rabbits were randomly subdivided into 3 groups:model group(n=5)；low-dose atorvastatin group(n=5)and high-dose atorvastatin group(n=5).All rabbits were kept feeding for 12 weeks.The enzyme-linked immunosorbent assay was applied to measure the serum TC,TG,LDL-C and VEGF of animals at the end of the 12th week;VEGF protein and mRNA in atherosclerotic plaque were detected.Results The serum LDL-C,TG,TC and VEGF in model group and atorvastatin groups at the 6th and 12th week were higher than those in control group(P<0.01);the serum lipid and VEGF in high-dose atorvastatin group decreased more than those in low-dose group(P<0.05);the level of VEGF protein in atherosclerotic plaque of the rabbits in atorvasatin groups dropped down more than that of the rabbits in model group and the decrease in high-dose group was more obvious(P<0.05).Conclusions The expression level of VEGF is high in serum and atherosclerotic plaque of rabbit' model and atorvastatin can down-regulate the expression level of VEGF in atherosclerotic plaque.

atherosclerosis;vascular endothelial growth factor(VEGF);atorvastatin;rabbit

南京軍區(qū)面上項目(12MB027)

350002 福州，南京軍區(qū)福州總院476醫(yī)院老年科(馬 曄，馬建芳)；福建省立醫(yī)院心內(nèi)科(關瑞錦)

R 543.5

A

1004-0188(2014)05-0465-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.05.001

2013-05-20)