響應(yīng)面法優(yōu)化靈芝子實(shí)體三萜提取工藝的研究

洪文龍，童斌，趙格

（江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212400）

1982年Kubora.T等首次從赤芝子實(shí)體中分離得到三萜類化合物。靈芝三萜是一個(gè)大的統(tǒng)稱，又稱為靈芝三萜類或總?cè)芠1]。三萜類（Trierponoides），以四環(huán)三萜化合物為主，具有抗癌、促進(jìn)肝功能、抗過敏、抗炎止痛之功效。靈芝中三萜含量很高，而其它藥用植物含量則很少。其他植物中也含有三萜類，但是靈芝所含有的特殊三萜類（或稱“靈芝酸”），為其他植物所沒有[2]。三萜類靈芝酸為保護(hù)肝功能的主要成分，具有強(qiáng)烈的藥理活性，有護(hù)肝、解毒和止痛等功能。如靈芝酸A、B、C和D能抑制細(xì)胞組織胺的釋放，靈芝酸F有很強(qiáng)烈的抑制血管緊張素酶的活性，靈芝酸R和S有強(qiáng)烈的抗病毒能力[3]。

試驗(yàn)通過有機(jī)溶劑加以超聲波輔助提取的方法研究了靈芝子實(shí)體三萜的提取方法，采用超聲提取工藝，縮短了提取時(shí)間、降低了提取溫度，其原因是超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、高的加速度、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、攪拌作用等，都可加速有效成分進(jìn)入溶劑，從而提高了提出率，縮短了提取時(shí)間，并且免去了高溫對提取成分的影響，對傳統(tǒng)的提取手段有了較大改進(jìn)[4]。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料

赤靈芝純子實(shí)體超細(xì)粉：上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海菇寶食用菌有限公司；標(biāo)準(zhǔn)齊墩果酸：上海金穗生物科技有限公司（≥98%）；95%乙醇、5%香草醛-冰乙酸、高氯酸、冰醋酸等：上海國藥試劑公司，為分析純。

1.2 設(shè)備

G＆G/雙杰JJ224BC型電子天平：UV-2100型紫外可見分光光度計(jì)；KQ3200 E型超聲波清洗器；HHS型電熱恒溫水浴鍋。

2 原理和操作方法

2.1 原理

三萜類物質(zhì)溶于有機(jī)溶劑，加入5%香草醛－冰醋酸溶液和高氯酸混勻，用三萜類化合物在加熱的條件下可以和香草醛－高氯酸試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，在550 nm處有最大吸光度，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算三萜含量。

2.2 靈芝三萜提取過程

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制→樣品超聲提取→過濾后棄初濾液→分光光度法測吸光度→根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算三萜提取率。

2.3 齊敦果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品17 mg，置100 mL容量瓶中，加無水乙醇至刻度。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 于試管中，另取 0 號試管加入無水乙醇1 mL，將所有試管置于沸水浴中揮去溶劑，加5%香草醛-冰乙酸0.3 mL，高氯酸1.0 mL，迅速用混合儀混均溶液。再將試管置于70℃水浴中加熱15 min，拿出用冰水冷卻至室溫，冰醋酸定容至10 mL，迅速混勻溶液，在550 nm處測定吸光值，以吸光度為縱坐標(biāo)，以齊墩果酸微克數(shù)為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)齊墩果酸的含量（μg）和吸光值（A）的關(guān)系，建立線性回歸方程[5]，見圖1。

圖1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Oleanolic acid standard curve

建立線性回歸方程：Y=0.055 X-0.009 4，R2=0.999 3。

2.4 樣品靈芝三萜得率測定

準(zhǔn)確稱取一定量1.0 g樣品，加乙醇進(jìn)行超聲處理，樣液加乙醇定容至100 mL，搖勻，過濾，棄去初濾液，收集濾液，吸1 mL濾液于試管中，參比管加1 mL無水乙醇。用測定標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的方法，測定樣品在550 nm處測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)的三萜含量，根據(jù)公式計(jì)算樣品三萜含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素變量試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)選擇95%乙醇、超聲頻率（50 Hz）為定量，檢測含量試驗(yàn)條件一致[6]。以超聲溫度、時(shí)間、料液比為變量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，驗(yàn)證分析各個(gè)單因素變量對提取率的影響及相互關(guān)系。

3.1.1 不同超聲時(shí)間對三萜化合物提取率的影響

稱取1.0 g的靈芝粉5份，分別于100 mL容量瓶中，按料液比1∶20分別加人95%，在60℃條件下，超聲頻率 50 Hz，提取時(shí)間分別為 30、40、50、60 min。提取后，樣液加乙醇定容至100 mL，搖勻，過濾，棄去初濾液，收集濾液，吸1 mL濾液于試管中，參比管加1 mL無水乙醇。用測定標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的方法，測定樣品在550 nm處測定吸光值，見圖2。

圖2 超聲時(shí)間對三萜化合物提取率的影響Fig.2 Ultrasonic time on the extraction rate of three terpene compounds

圖2 可以看出隨著時(shí)間的增加，其提取率的變化很明顯，提取率先升后降，相同條件下，當(dāng)超聲處理時(shí)間為50 min時(shí)，提取效果最好。

3.1.2 不同料液比對三萜化合物提取率的影響

稱取1.0 g的靈芝粉5份，分別于100 mL容量瓶中，分別按料液比 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 加人 95%乙醇，在60℃條件下，超聲頻率50 Hz，提取時(shí)間分別為50 min。提取后，樣液加乙醇定容至100 mL，搖勻，過濾，棄去初濾液，收集濾液，吸1 mL濾液于試管中，參比管加1 mL無水乙醇。用測定標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的方法，測定樣品在550 nm處測定吸光值，見圖3。

圖3 料液比對三萜化合物提取率的影響Fig.3 Effects of ratio of material to liquid on the extraction rate of three terpene compounds

圖3 可以看出隨著料液比的增加，其提取率的變化很明顯，提取率先升后降，相同條件下，當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，提取效果最好。

3.1.3 不同溫度對三萜化合物提取率的影響

不同溫度對三萜化合物提取率的影響，見圖4。

圖4可以看出隨著提取溫度的增加，其提取率的變化很明顯，提取率先升后降，相同條件下，當(dāng)處理溫度為50℃時(shí)，提取效果最好。

3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

圖4 溫度對三萜化合物提取率的影響Fig.4 Effects of temperature on extraction rate of three terpene compounds

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)原理，綜合單因素影響試驗(yàn)結(jié)果，選取超聲溫度、超聲時(shí)間、料液比對靈芝三萜提取率的影響，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[7]，分析因素見下表1所示。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factor and levels of RSM experiment

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，用上表設(shè)計(jì)的三因素三水平方式分別進(jìn)行17組實(shí)驗(yàn)，以提取率為考察指標(biāo)，確定最佳提取工藝，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

建立模型方程與顯著性檢驗(yàn)應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到靈芝總?cè)频寐逝c超聲提取各因素變量的二次方程模型為：

提取率（%）=1.27+0.040A+0.023B+0.019C+2.0× 10-3AB+3.25×10-3AC+0.016BC-0.088A2-0.054B2-0.043C2

表2 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及影響值Table 2 Program of Box-Behnken experimental design and response value

從表3可以看出，由模型上F值大小可知，三因素對響應(yīng)值的影響為：A＞B＞C，由P值的大小可以判斷三因素均為極顯著，同時(shí)也可看到方程的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)、交互項(xiàng)均達(dá)到顯著水平，自變量和應(yīng)變量之間不是簡單的線性關(guān)系，說明方程的擬合是較充分的[8]。

模型中F=82.303（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)檢驗(yàn)F=4.828（P=0.081 2＞0.05），溝通無布局說明用上述回歸方程描述各因素之間的關(guān)系時(shí)，其因變量與全體自變量的線性關(guān)系顯著、可靠?？捎迷撃Ｐ蛯`芝三萜的提取率進(jìn)行分析和預(yù)測。

相應(yīng)面曲面分析的圖形是特定的響應(yīng)值對應(yīng)變量構(gòu)成的一個(gè)三維空間圖，可以直觀地反映此處各自自變量對響應(yīng)變量的影響，運(yùn)用軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到響應(yīng)面圖，分別如下。

表3 回歸方程方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis for regression equantion

圖5 提取時(shí)間與溫度對提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time and temperature on extraction rate

由圖5可以看出在料液比為1∶20時(shí)，提取溫度和時(shí)間對提取率的交互影響，隨著提取溫度的增加，提取率先升后降，隨著提取時(shí)間的增加，提取率也是先升后降，同時(shí)可以看出在溫度為50℃，時(shí)間為50 min時(shí)，交界處附近有極值。

圖6 提取時(shí)間與溫度對提取率影響的等高線Fig.6 Contour extraction time and temperature on extraction rate

由圖6的等高線圖可以看出兩者間的交互作用呈現(xiàn)曲線而不是直線，說明兩者之間的交互作用是顯著的。

圖7 料液比與提取溫度對提取率的影響Fig.7 Liquid ratio and extraction temperature on extraction rate

由圖7可以看出在提取時(shí)間為50min時(shí)，提取溫度和料液比對提取率的交互影響，隨著提取溫度的增加，提取率先升后降，隨著料液比的增加，提取率也是先升后降，同時(shí)可以看出在溫度為50℃，料液比為1：20時(shí)，交界處附近有極值。

圖8 料液比與提取溫度對提取率影響的等高線Fig.8 The material liquid ratio and extraction temperature on extraction rate of contour

由圖8的等高線圖可以看出兩者間的交互作用呈現(xiàn)曲線而不是直線，說明兩者之間的交互作用是顯著的。

圖9 料液比與提取時(shí)間對提取率影響Fig.9 The material liquid ratio and extraction time on the extraction rate of contour

由圖9可以看出在提取溫度為50℃，時(shí)，提取時(shí)間和料液比對提取率的交互影響，隨著提取時(shí)間的增加，提取率先升后降，隨著提取料液比的增加，提取率也是先升后降，同時(shí)可以看出在提取時(shí)間為50 min時(shí)，料液比為1∶20時(shí)，交界處附近有極值。

圖10 料液比與提取時(shí)間對提取率影響的等高線Fig.10 The ratio of material to liquid and extraction time on the extraction rate of contour

由圖10的等高線圖可以看出兩者間的交互作用呈現(xiàn)曲線而不是直線，說明兩者之間的交互作用是顯著的。

4 結(jié)論

對回歸方程求導(dǎo)，并令其等于零，可以得到曲面的最大點(diǎn)，即3個(gè)主要因素的最佳水平值，分別為：A=0.00，B=0.00，C=0.00，轉(zhuǎn)換后得到提取的最佳條件為：提取溫度為50℃，提取時(shí)間50 min，料液比為1∶20，預(yù)測靈芝三萜提取率為1.27%。通過軟件可看出實(shí)際與預(yù)測的提取率較為接近，說明該模型適用于靈芝三萜提取工藝的優(yōu)化。

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