陳 俊 張 偉 翁秀芳 陸盛軍 吳雄文 梁智輝

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，武漢 430030)

移植物抗宿主病是骨髓移植后出現(xiàn)的多系統(tǒng)損害的全身性疾病，是造成死亡的重要原因之一。臨床表現(xiàn)較為復(fù)雜，皮膚損害最早出現(xiàn)的癥狀有紅斑、丘疹、水皰，甚至皮膚剝脫，嚴(yán)重者皮損可在數(shù)天內(nèi)擴(kuò)展至全身。移植物抗宿主反應(yīng)是一種特異的免疫現(xiàn)象，是由于移植物組織中的免疫活性細(xì)胞與免疫受抑制的、組織不相容性抗原受者的組織之間的反應(yīng)。異種急性移植物抗宿主病模型是研究異種移植的有效途徑，該模型可在受者體內(nèi)觀察供者免疫細(xì)胞對受者組織的攻擊，進(jìn)一步明確移植物抗宿主排斥反應(yīng)情況;該模型還可用于體內(nèi)藥敏實驗研究，預(yù)測指導(dǎo)臨床治療方案的選擇和設(shè)計，以及探索放療、內(nèi)分泌治療、免疫治療、基因治療及分子靶向治療等新型治療手段［1］。

目前對“人-鼠”模型的報道也較多，在選用動物的品系及種類等各方面都有不同的報道。本研究主要探討選擇合適小鼠品系，優(yōu)化相關(guān)實驗條件，建立穩(wěn)定的“人-鼠”異種移植物抗宿主病(X-GVHD)模型，為異種移植提供可靠的實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 裸鼠:購自武漢大學(xué)動物實驗中心，BALB/c-nu，無菌級，雌性，4～5周齡，體重約12 g，質(zhì)量合格證書編號00001655，飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物中心。

非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠:購自北京華阜康生物科技股份有限公司，NOD/SCID，SPF級，雌性，5～6周齡，體重15 g，質(zhì)量合格證書編號0180764，飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物中心。

1.1.2 試劑 RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液為Gibco公司產(chǎn)品;胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品;人CD3、CD4、CD8等抗體購自Biolegend公司。

1.2 方法

1.2.1 X-GVHD模型小鼠的品系選擇 參照相關(guān)文獻(xiàn)，結(jié)合動物的易獲得性及飼養(yǎng)條件，本實驗選取裸鼠和NOD/SCID鼠建立“人-鼠”X-GVHD模型。兩種小鼠均接受全身γ射線照射(300 cGy)，之后隨機分組如表 1，參考相關(guān)文獻(xiàn)，選擇7×107～8×107細(xì)胞，以腹腔輸注途徑輸注人PBMC［2-7］。輸注后第10天，采用流式細(xì)胞術(shù)及免疫組化檢測各組小鼠體內(nèi)各臟器中人淋巴細(xì)胞的浸潤情況。

1.2.2 人PBMC輸注途徑的選擇 常用的輸注途徑為腹腔和尾靜脈［5，8］，現(xiàn)設(shè)置實驗探討兩種輸注途徑對建立模型是否有影響。由1.2.1的結(jié)果可知，NOD/SCID小鼠較裸小鼠更易建立“人-鼠”X-GVHD模型，故選用NOD/SCID小鼠，按照前期處理方案處理之后，隨機分為對照組、腹腔輸注組、尾靜脈輸注組，腹腔輸注組通過腹腔輸注途徑輸注7×107～8×107人PBMC，尾靜脈輸注組通過尾靜脈途徑輸注7×107～8×107人 PBMC，對照組腹腔輸注等體積的PBS。

1.2.3 建立X-GVHD模型最適細(xì)胞量的確定 由

1.2.1 、1.2.2 可知，NOD/SCID 小鼠采用腹腔輸注途徑，可較好的建立“人-鼠”X-GVHD模型?，F(xiàn)設(shè)置實驗，探索建立模型的最適細(xì)胞量。選取NOD/SCID小鼠，按照前期處理方案處理之后，隨機分為對照組、實驗組 1(2×107～3×107)、實驗組 2(4×107～5×107)、實驗組3(5×107～6×107)、實驗組4(7×107～8×107)。

1.2.4 觀察人T細(xì)胞表型動態(tài)變化與功能的最佳時間 第5天開始，模型鼠尾靜脈采血。加入推薦量的人CD3抗體后，于4℃避光孵育45 min，用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，PBS洗滌后上機檢測。

2 結(jié)果

2.1 NOD/SCID 鼠適合建立“人-鼠”X-GVHD 模型

第10天眼球取血處死小鼠，檢測模型鼠靜脈血及各臟器中人T細(xì)胞浸潤情況。NOD/SCID模型鼠外周血中人T細(xì)胞浸潤比例高達(dá)(69.53±8.49)%，而裸鼠實驗組僅為(5.6±1.81)%(圖 1)。H＆E 染色結(jié)果顯示，NOD/SCID實驗組較裸鼠實驗組浸潤情況嚴(yán)重。肺臟血管周圍聚集大量人的相關(guān)免疫細(xì)胞(圖2)，與流式結(jié)果吻合。其他臟器的情況與肺臟趨勢一樣，NOD/SCID實驗組較裸鼠實驗組浸潤情況嚴(yán)重。

2.2 腹腔輸注途徑與尾靜脈輸注途徑無明顯差異

第10天時眼球取血檢測外周血中人T細(xì)胞所占比例，其中，腹腔輸注組人 T細(xì)胞所占比例為(69.53±8.49)%，尾靜脈輸注組人T細(xì)胞所占比例為(71.20±5.78)%，腹腔輸注途徑與尾靜脈輸注途徑無統(tǒng)計學(xué)差異(圖3)。由于腹腔輸注途徑較尾靜脈輸注途徑方便，故采用腹腔輸注途徑。

2.3 每只輸注5×107以上的人PBMC能夠建立“人-鼠”X-GVHD模型 100%死亡率代表100%XGVHD模型成功率。如圖4所示，輸注2×107～3×107人PBMC，有50%無法完全構(gòu)建成功;輸注4×107～5×107人PBMC，有25%無法完全構(gòu)建成功;輸注5×107～6×107人PBMC，可以全部構(gòu)建成功，平均生存時間為(14.5±2.2)d;輸注 7×107～8×107人PBMC，也可以全部構(gòu)建成功，平均生存時間為(12±1.4)d。因此，可以得出結(jié)論:腹腔輸注 5×10以上的人PBMC可以穩(wěn)定建立X-GVHD模型。

表1 實驗小鼠分組Tab.1 Groups of mice

2.4 觀察人T細(xì)胞表型動態(tài)變化與功能的最佳時間為7～11 d 由圖5可知，第5天時人T細(xì)胞在小鼠外周血中浸潤比例較低，第11天時浸潤達(dá)到最高，之后進(jìn)入平臺期。因此，我們認(rèn)為7～11 d為觀察人T細(xì)胞表型動態(tài)變化與功能的最佳時間。

圖1 NOD/SCID鼠適合建立“人-鼠”X-GVHD模型Fig.1 NOD/SCID mice suitable for establishment of＂human-mouse＂ X-GVHD model

圖2 NOD/SCID實驗組模型小鼠肺臟組織血管周圍有較多的人淋巴細(xì)胞浸潤(H＆E，×400)Fig.2 More human lymphocyte infiltration lung tissue in NOD/SCID experimental group(H＆E，×400)

圖3 腹腔輸注途徑與尾靜脈輸注途徑無明顯差異Fig.3 No significant difference between intraperitoneal infusion and intravenous infusion

圖4 每只輸注5×107以上的人PBMC能夠建立“人-鼠”X-GVHD模型Fig.4 Each mice infusion of more than 5×107 human PBMC can establish ＂human-mouse＂ X-GVHD model

圖5 觀察人T細(xì)胞表型動態(tài)變化與功能的最佳時間為7～11 dFig.5 Best time to observe human T cell phenotype dynamics and function is 7 to 11 days

3 討論

GVHD發(fā)生需要的一些特定條件［9-12］:①宿主與移植物之間的組織相容性不合;②移植物中必需含有足夠數(shù)量的免疫細(xì)胞;③宿主處于免疫無能或免疫功能嚴(yán)重缺損狀態(tài)。

裸小鼠是由于染色體上等位基因(第11對染色體上)突變引起的，已經(jīng)沒有正常的胸腺，原胸腺殘留結(jié)構(gòu)部分上皮樣細(xì)胞呈巢狀排列而部分呈外分泌腺結(jié)構(gòu)。由于無胸腺，僅有胸腺殘跡或異常上皮，而這種上皮不能使T細(xì)胞正常分化，從而缺乏成熟T細(xì)胞的輔助、抑制及殺傷功能，因而細(xì)胞免疫力低下。裸小鼠B淋巴細(xì)胞正常，但功能不全，免疫球蛋白主要是IgM，只含少量IgG。

NOD/SCID正式名稱為 NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl，為SCID突變(Prkdcscid)基因被轉(zhuǎn)至 nonobese diabetic(NOD)的小鼠，Prkdcscid基因位于第十六對染色體上，轉(zhuǎn)譯為DNA-activated protein kinase(DNA-APK)催化的次單位，由于DNA-APK缺陷而影響淋巴干細(xì)胞分化為成熟的免疫細(xì)胞。NOD/SCID為近親品系，是非肥胖糖尿病小鼠NOD/Lt與SCID小鼠雜交的［13］，而SCID的特征為喪失B與T淋巴細(xì)胞的功能［14］，NOD/Lt與SCID小鼠雜交得到NOD/SCID小鼠，除了喪失B與T淋巴細(xì)胞的功能特性外，還降低了 NK 細(xì)胞活性［15］，即 T、B、NK 三缺陷［16］。

由于裸鼠僅僅是T細(xì)胞缺陷，而B細(xì)胞、NK細(xì)胞以及其自身免疫相對較強，300 cGy的γ射線照射也不能使其長時間處在免疫無能或免疫功能嚴(yán)重缺損狀態(tài)，輸注的PBMC未能引發(fā)GVHD的發(fā)生也就不奇怪了。而NOD/SCID小鼠，由于T、B、NK三缺陷，再加上300 cGy的γ射線照射，免疫無能或免疫功能嚴(yán)重缺損狀態(tài)是完全可以達(dá)到的，只要輸注足夠數(shù)量的PBMC［2-7］，必定可以導(dǎo)致GVHD的發(fā)生。

文獻(xiàn)報道選擇裸鼠具有以下優(yōu)勢:①國內(nèi)有相關(guān)文獻(xiàn)報道裸鼠可以建立“人-鼠”X-GVHD模型;②裸鼠較其他免疫缺陷鼠有價格優(yōu)勢，且易于購買;③飼養(yǎng)成本較低廉。但我們的實驗結(jié)果顯示，每只腹腔輸注8×10 以上的人PBMC，使用裸鼠建立“人-鼠”X-GVHD模型成功率較低，只有 23.5%，而NOD/SCID小鼠成功建立“人-鼠”X-GVHD模型。經(jīng)相關(guān)優(yōu)化手段優(yōu)化后，通過腹腔輸注5×107人PBMC，可以穩(wěn)定的建立“人-鼠”X-GVHD模型。結(jié)果還提示，輸注后第7～11天是尾靜脈動態(tài)觀察過繼的免疫細(xì)胞表型與功能的最佳時間窗口。

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