黎美琳 周春華 王少峰

蛋白酶體抑制劑硼替佐米(萬珂，velcade)是一種新型抗腫瘤制劑，由于其對血源性惡性腫瘤的突出效應，已被美國食品藥品管理局(FDA)批準用于反復性或頑固性的多發(fā)性骨髓瘤治療[1]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，硼替佐米對大部分腫瘤具有抗癌活性，包括小細胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌等。硼替佐米與化療藥物聯(lián)用治療實體腫瘤的Ⅰ期、Ⅱ期臨床試驗也取得初步進展[2]。體內和體外實驗研究結果均顯示硼替佐米單藥或聯(lián)合其他化療藥物可殺傷胰腺癌細胞，抑制腫瘤的生長[3-4]，但不同癌細胞對硼替佐米的敏感性差異甚大[5]，且與治療敏感性相關的分子機制研究鮮有報道。本研究應用硼替佐米干預胰腺癌細胞BxPC3、SW1990，觀察其對癌細胞增殖、凋亡的影響，探討硼替佐米殺傷癌細胞及其敏感性的可能機制。

材料與方法

一、材料

人胰腺癌細胞株BxPC3、SW1990購自上海生命科學院細胞庫；硼替佐米由西安楊森公司提供；四甲基偶氮唑鹽(MTT)為Sigma公司產品；Trizol RNA提取試劑、凋亡檢測試劑盒購自Introvinent公司；cDNA逆轉錄試劑盒為Fermentas公司產品，SYBR Green Mix for Q-PCR 為ABI公司產品；兔抗人survivin、caspase、cleaved-caspase、Bcl-2的IgG及鼠抗人GAPDH IgG，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔及羊抗鼠IgG均購自Cell Singaling Technology公司。

二、方法

1．細胞增殖檢測：采用MTT法檢測細胞增殖。取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后制備成單個細胞懸液，調整細胞密度至5×104/ml，取100 μl接種于96孔板培養(yǎng)過夜，分別加入1、10、50、100、500 nmol/L及1、10 μmol/L的硼替佐米，以不加硼替佐米為對照組，不加細胞為空白組，分別孵育24、48、72 h，加入10 μl MTT(5 mg/L)避光孵育4 h，棄上清，每孔加150 μl DMSO，振蕩搖勻，置酶標儀測各孔490 nm的吸光度值(A490值)。每組設3個平行孔。細胞存活率(%)=(實驗組A490值-空白組A490值/對照組A490值-空白組A490值)×100%。

2．細胞凋亡檢測：采用Annexin V/PI雙染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡。細胞以5×105個/孔的密度接種于6孔板，孵育過夜，分別加入10、50、100 nmol/L的硼替佐米孵育48 h，以不加硼替佐米為對照組。孵育后收集細胞，PBS洗滌2次，用1× binding buffer 1 ml重懸細胞，取100 μl細胞懸液加入5 μl Annexin V-FLTC和1 μl PI(100 μg/ml)，室溫避光放置15 min，再加入400 μl 1× binding buffer，混勻后上流式細胞儀檢測。

3．凋亡相關基因Bak、Bax、Bcl-2、Bcl-xl、survivin mRNA表達檢測：采用RT-PCR法檢測mRNA的表達。取10、100 nmol/L硼替佐米干預48 h的細胞及未經硼替佐米干預的對照組細胞，用Trizol提取細胞總RNA。引物序列：Bax上游5′-GGGGACGAACTGGACAGTAA-3′，下游5′-CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA-3′，產物122 bp；Bak上游5′-GCTATGACTCAGAGTTCCAGACCA-3′，下游5′-CAATTGATGCCACTCTCAAACAG-3′，產物111 bp；Bcl-2上游5′-TTTGAGTTCGGTGGGGTCAT -3′，下游5′-TTCAGAGACAGCCAGGAGAAAT-3′，產物203 bp；Bcl-xl上游5′-GTAAACTGGGGTCGCATTGT-3′，下游5′-TGCTGCATTGTTCCCATAGA-3′，產物197 bp；survivin上游5′-AGGACCACCGCATCTCTACAT-3′，下游5′-AAGTCTGGCTCGTTCTCAGTG-3′，產物118 bp；內參GAPDH上游5′-GTGGTCTCCTCTGACTTCAAC-3′，下游5′-TCTCTTCCTCTTGTGCTCTTG-3′，產物212 bp。引物序列由上海生工生物技術有限公司設計合成。先按照Fermentas試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA，然后行PCR擴增。PCR條件：95℃ 5 min，50℃(Bax)或52℃(Bcl-xl)或55℃(Bak、Survivin、GAPDH)或56℃(Bcl-2) 30 s、72℃ 60 s，30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，圖像分析儀掃描，以目的條帶與內參條帶灰度值比表示mRNA的相對表達量。

4．Pro-caspase-3、cleaved-caspase-3、Bax、Bcl-2、surviving蛋白表達檢測：收集上述各組細胞，裂解后離心，取上清，蛋白定量。取50 μl常規(guī)行蛋白質印跡法檢測pro-caspase-3、cleaved-caspase-3、Bax、Bcl-2、surviving蛋白的表達，以GAPDH為內參，最后ECL發(fā)光，壓片，曝光，圖像分析儀掃描。以目的條帶與內參條帶灰度值比表示蛋白相對表達量。

三、統(tǒng)計學處理

結 果

一、BxPC3、SW1990細胞增殖的變化

大于50 nmol/L的硼替佐米呈濃度及時間依賴性抑制胰腺癌BxPC3、SW1990細胞的增殖，其中硼替佐米對BxPC3細胞的生長抑制作用顯著大于對SW1990細胞的作用，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05，表1)。

二、BxPC3、SW1990細胞凋亡的變化

對照組及10、50、100 nmol/L硼替佐米干預48 h的BxPC3細胞凋亡率分別為(2.15±0.47)%、(2.36±1.15)%、(10.52±1.05)%、(22.56±4.23)%；SW1990細胞凋亡率分別為(2.32±0.54)%、(2.27±1.37)%、(6.23±0.34)%、(12.71±2.23)%(圖1)。

表1 硼替佐米干預BxPC3、SW1990細胞后的細胞存活率

橫坐標為Annexin V-FLTC熒光強度；縱坐標為PI熒光強度

50、100 nmol/L硼替佐米組凋亡率均顯著高于對照組(t值分別為-12.595、-7.942和-10.535、-7.857，P值均<0.05)，且BxPC3細胞的凋亡率顯著高于SW1990細胞(t值分別為6.715、3.443,P值均<0.05)。

三、BxPC3、SW1990細胞凋亡相關基因mRNA表達水平的變化

10、100 nmol/L硼替佐米處理48 h后，兩種胰腺癌細胞Bak mRNA的表達量無顯著變化；Bax mRNA的表達量較相應對照組均顯著升高(F值分別為207.802、61.532，P值均<0.05)；Bcl-2、Bcl-xl mRNA的表達量均較相應對照組顯著下降(F值分別為194.249、116.067和48.931、145.512，P值均<0.05)；survivin在BxPC-3細胞中表達下調(F=76.877，P<0.05)，在SW1990細胞中表達上調(F=103.244，P<0.05，圖2、表2)。

四、BxPC3、SW1990細胞凋亡相關基因蛋白表達水平的變化

10、100 nmol/L硼替佐米干預后，BxPC3、SW1990細胞pro-caspase-3表達減弱(F值分別為257.098、384.099，P值均<0.05)，cleaved-caspase-3表達增強(F值分別為295.561、48.735,P值均<0.05)，Bax蛋白表達增強(F值分別為116.233、207.271，P值均<0.05)，Bcl-2蛋白表達減弱(F值分別為233.143、428.702，P值均<0.05)，組間差異均有統(tǒng)計學意義；survivin蛋白在BxPC3細胞表達明顯減弱(F=3512.366，P<0.05)，而在SW1990細胞中持續(xù)高表達(F=45.265，P<0.05，圖3、表2)。

圖2 0、10、100 nmol/L硼替佐米作用48 h后BxPC3和SW1990細胞相關基因mRNA表達

圖3 0、10、100 nmol/L硼替佐米作用48 h后BxPC3和SW1990細胞相關蛋白表達

表2 硼替佐米處理后兩種胰腺癌細胞凋亡相關基因mRNA和蛋白表達量

討 論

硼替佐米可誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤生長，其機制主要包括以下幾個方面[6-7]：(1)抑制NF-κB信號通路的激活；(2)增加細胞內抑癌基因p53、p21、p27的表達；(3)誘導線粒體內源性凋亡途徑；(4)激活死亡受體外源性凋亡信號；(5)內質網介導的凋亡信號激活。

Bcl-2蛋白家族可分為抗凋亡成員和促凋亡成員，后者僅BH3域具有同源序列。細胞在應激狀態(tài)下，同源BH3結構域的促凋亡蛋白作為感應元件，直接抑制抗凋亡蛋白和(或)激活Bax類促凋亡蛋白，增加線粒體膜通透性，釋放細胞色素C，激活caspase-3，誘導其聯(lián)級反應致細胞凋亡[8]。Bcl-2家族的抗凋亡蛋白持續(xù)高表達在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[9]。本研究結果顯示，硼替佐米抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，Bcl-2、Bcl-xl表達減弱，Bax表達增強，caspase-3裂解激活，提示硼替佐米干預細胞后可能通過抑制抗凋亡蛋白、增強促凋亡蛋白表達，誘導線粒體途徑凋亡的發(fā)生。本研究的兩株癌細胞Bak表達無顯著變化，可能與Bak主要表達于胰腺癌組織周圍慢性炎性區(qū)域，參與此部位細胞凋亡而非腫瘤細胞本身有關[10]。

Survivin是凋亡蛋白抑制因子家族成員之一，通過與caspase-3和caspas-7結合而抑制caspase聯(lián)級反應，從而抑制細胞凋亡的發(fā)生。survivin主要表達于胚胎和發(fā)育的胎兒組織，在分化成熟的正常成人組織中幾乎不表達。多項研究表明，survivin與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，放、化療的抵抗性以及預后不良有關。Vaziri等[11]研究表明，硼替佐米誘導的p53+/+表型的HCT116結腸癌細胞的凋亡增加與survivin表達下調相關。但Liu等[12]報道，硼替佐米誘導的非小細胞肺癌細胞株凋亡卻伴隨survivin表達升高。最新研究報道，硼替佐米殺傷結腸癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、多發(fā)性骨髓瘤等腫瘤細胞的敏感性與survivin表達呈負相關。抑制survivin表達可逆轉腫瘤細胞對硼替佐米的抵抗性[5]。本研究結果顯示，對硼替佐米敏感性高的BxPC3細胞的survivin表達明顯低于對硼替佐米敏感性低的SW1990細胞，提示survivin高表達可能在硼替佐米腫瘤抵抗中起作用。

參 考 文 獻

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