張斌斌，陳義鋼，丁厚中*

（1.昆山市中醫(yī)院病理科，江蘇昆山215300；2.江蘇大學附屬昆山醫(yī)院綜合外科，江蘇昆山215300）

膽囊癌組織中微淋巴管密度的檢測意義

張斌斌1，陳義鋼2，丁厚中2*

（1.昆山市中醫(yī)院病理科，江蘇昆山215300；2.江蘇大學附屬昆山醫(yī)院綜合外科，江蘇昆山215300）

目的：探討使用D2-40（淋巴管內(nèi)皮細胞標志物）檢測膽囊癌組織中微淋巴管密度（lymphatic microvessel density，LMVD）的臨床意義。方法：應用組織芯片和免疫組織化學（S-P法）技術(shù)以D2-40單克隆抗體檢測59例膽囊癌（其中肝臟侵犯13例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例）的癌中心與癌周組織和6例正常膽囊組織中LMVD的表達，并分析其與膽囊癌病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果：LMVD在膽囊癌周邊組織中的表達明顯高于正常膽囊組織和癌中心組織中的表達（P＜0.01）。在膽囊癌中，D2-40陽性表達與患者性別、年齡、肝臟侵犯無關(guān)（P＞0.05），而與膽囊癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期（Nevin分期）有關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論：D2-40可以特異性識別人膽囊癌組織中微淋巴管內(nèi)皮細胞，其標記的微淋巴管主要分布于癌周組織；LMVD可用來評估膽囊癌淋巴轉(zhuǎn)移風險。

組織芯片；膽囊癌；D2-40

膽囊癌是預后較差的惡性腫瘤之一，早期易發(fā)生轉(zhuǎn)移，一旦發(fā)現(xiàn)多為晚期［1］，其轉(zhuǎn)移途徑大多通過直接轉(zhuǎn)移、淋巴道轉(zhuǎn)移等，腫瘤細胞侵犯進入淋巴管及腫瘤內(nèi)淋巴管侵犯（lymphatic vessel invasion，LVI）是腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要步驟［2－3］。以往外科手術(shù)大多主張行膽囊癌擴大根治術(shù)，而目前臨床上對膽囊癌的外科大范圍淋巴結(jié)清掃尚存在著不同爭論［4］，因此有必要對膽囊癌組織、癌旁組織與正常膽囊組織中的淋巴管密度等進行相關(guān)研究，從而為外科淋巴結(jié)大范圍清掃價值的討論提供參考。2002年Kahn等［5］發(fā)現(xiàn)了一種比較特異的淋巴管內(nèi)皮細胞標志物D2-40，其抗體對淋巴管上皮有較高的特異性和敏感性，可用于淋巴管形成和計數(shù)研究［6］。目前國內(nèi)外對微淋巴管密度（lymphatic microvessel density，LMVD）與膽囊癌相互關(guān)系的研究較少，本研究以D2-40單克隆抗體應用組織微陣列、免疫組織化學技術(shù)（S-P法）檢測了膽囊癌、癌旁組織和正常膽囊中LMVD的表達情況，并嘗試探討LMVD與膽囊癌生物學行為的相關(guān)性及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標本來源

組織芯片為我科室構(gòu)建保存。該芯片（圖1）含有59例膽囊癌術(shù)后標本，其中男21例，女38例。60歲以下21例，60歲及60歲以上38例，平均年齡63.7歲。病理診斷結(jié)果經(jīng)兩名以上病理醫(yī)師確認。腺癌54例，腺鱗癌4例，未分化癌1例，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例，肝臟侵犯13例。臨床分期采用膽囊癌Nevin分期（1976），其中Ⅰ期5例（8.5%），Ⅱ期8例（13.6%），Ⅲ期21例（35.6%），Ⅳ期7例，（11.9%），V期18例（30.5%）。另取6例正常膽囊組織標本（上海第二軍醫(yī)大學尸檢標本）作對照。

圖1 膽囊癌組織芯片

1.2 免疫組織化學檢測

1.2.1 抗體來源 鼠抗人D2-40單克隆抗體（即用型）及S-P免疫組化試劑盒購自福州邁新公司。免疫組化技術(shù)采用S-P法，PBS替代一抗作陰性對照。1.2.2 結(jié)果判斷 D2-40抗體標記的淋巴管判斷標準：棕黃色的內(nèi)皮細胞形成的條狀管腔或隙狀管腔，以胞質(zhì)或胞膜呈清晰棕黃色顆粒為陽性表達。先在低倍鏡（×40或×100）下掃描膽囊癌腫瘤周邊區(qū)（即腫瘤組織與正常組織交接的區(qū)域）、腫瘤中心區(qū)，選擇其中高淋巴管密度區(qū)，然后在高倍鏡（× 400）下計數(shù)被D2-40抗體染成棕色的淋巴管數(shù)目，每個染成棕色的內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇，只要與鄰近脈管、腫瘤細胞或其他結(jié)締組織分開，即視為一個淋巴管。結(jié)果以5個高倍視野下的淋巴管均數(shù)表示。分別測定膽囊癌腫瘤中心區(qū)、周邊區(qū)以及正常膽囊組織的LMVD。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有結(jié)果均在SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包上進行處理，計量資料數(shù)據(jù)用±s表示，兩個樣本均數(shù)之間的比較采用t檢驗，3個樣本均數(shù)之間的比較采用方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 膽囊癌中D2-40的表達

D2-40的陽性表達主要定位于淋巴管內(nèi)皮細胞胞質(zhì)或胞膜，為棕黃色顆粒，淋巴管形態(tài)呈管狀或裂隙狀，周邊區(qū)淋巴管數(shù)量較多，而中心區(qū)數(shù)量較少。見圖1。

膽囊癌周組織LMVD為8.91～16.35個，平均為（13.38±2.45）個；中心區(qū)LMVD為2.41～7.30個，平均為（4.90±1.90）個；正常組織LMVD為1.92～3.67個，平均為（2.70±0.83）個。癌周邊區(qū)LMVD明顯高于中心區(qū)和正常組織，差異有統(tǒng)計學意義（t＝22.881，P＜0.01；t＝8.130，P＜0.01）。

圖1 膽囊癌周邊區(qū)及中心區(qū)免疫組化結(jié)果（S-P法×100）

2.2 膽囊癌LMVD與臨床病理參素間的關(guān)系

膽囊癌周邊區(qū)LMVD與腫瘤的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），而與患者的年齡、性別、肝臟侵犯均無關(guān)（P＞0.05），見表1。

表1 膽囊癌組織中LMVD的陽性表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

腫瘤的形成與生長是一個多因素、多步驟的過程［7］，其中腫瘤誘導的腫瘤相關(guān)淋巴管生成與腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)［8］。腫瘤組織內(nèi)新生的腫瘤相關(guān)淋巴管僅由單層細胞組成，無基底層結(jié)構(gòu)，并且內(nèi)皮細胞間的緊密連接少，存在較多腔隙，這些因素都有利于腫瘤細胞的淋巴管轉(zhuǎn)移。而由于淋巴管特異性標志物的缺乏，對腫瘤淋巴管的研究一直存在爭議，并因為缺乏基礎理論的支持，臨床上對大范圍淋巴結(jié)清掃的價值一直存在爭論。

D2-40是新近發(fā)現(xiàn)的一種相對分子質(zhì)量為40 000的淋巴管內(nèi)皮細胞標志物，大量研究表明其作為淋巴管內(nèi)皮細胞的一種特異性標志物可用于識別正常和腫瘤組織中的淋巴管。D2-40可與癌胚抗原M2A特異性結(jié)合，M2A表達于淋巴管內(nèi)皮細胞而不表達于血管內(nèi)皮，因此D2-40被廣泛應用于腫瘤淋巴管與腫瘤生物學關(guān)系的研究，是目前相對較好的淋巴管內(nèi)皮細胞標志物［9－10］。Choi等［11］通過RT-PCR和免疫組化技術(shù)對29例乳腺癌標本用D2-40作淋巴管密度檢測，發(fā)現(xiàn)癌組織中淋巴管密度不僅與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度有關(guān)，而且可以用來估計腫瘤的轉(zhuǎn)移及患者預后情況。Cao等［12］用D2-40對1 072例胃癌標本作免疫組化檢測，結(jié)果顯示LVI是胃瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要步驟，LVI與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)，N分期越高，LVI發(fā)生率也升高。

本研究中，D2-40染色陽性的微淋巴管顯示清晰，與周圍背景色對比良好，充分表明D2-40標記淋巴管特異性強，能夠很好區(qū)別微血管與微淋巴管，可作為臨床病理上鑒別膽囊癌微淋巴管的可靠標志物。本研究通過對59例膽囊癌癌周及癌中心組織和6例正常膽囊組織微淋巴管的標記和計數(shù)發(fā)現(xiàn)，膽囊癌周邊組織中LMVD的表達明顯高于癌中心組織（P＜0.01），可能反映了癌細胞向周圍侵襲的生物學特性以及淋巴管在該過程的重要性；本研究結(jié)果顯示LMVD與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及Nevin分期相關(guān)，N分期越高，LMVD發(fā)生率也升高，說明LMVD與膽囊癌進展、轉(zhuǎn)移及侵襲潛力有密切關(guān)系，LMVD可能是反映膽囊癌預后的重要客觀指標。本研究顯示，膽囊癌周邊區(qū)淋巴管呈不規(guī)則形擴張，而在膽囊癌中心區(qū)淋巴管數(shù)量明顯減少，僅有少數(shù)淋巴管呈不規(guī)則狀擴張，明顯不及腫瘤周邊微淋巴管數(shù)量多。膽囊癌周邊區(qū)LMVD明顯高于中心區(qū)和正常組織，該現(xiàn)象可能提示膽囊癌中淋巴管的形成主要位于周邊區(qū)，并且是有功能的，中心區(qū)淋巴管則大多數(shù)為無功能的，不過具體機制有待進一步研究。

總之，本研究應用D2-40標記淋巴管內(nèi)皮，對膽囊癌、癌旁組織和正常膽囊中D2-40的不同表達作相關(guān)分析，證明LMVD與膽囊癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Nevin分期相關(guān)，N分期越高，LMVD密度也高。本文再一次佐證了臨床上根據(jù)膽囊癌Nevin分期的不同選擇不同的淋巴結(jié)清掃范圍（Ⅰ期單純膽囊切除、Ⅱ期采用根治手術(shù)，Ⅲ、Ⅳ期根據(jù)腫瘤侵犯不同的部位或器官采取不同的擴大根治術(shù)）有一定的科學性。但本研究病例數(shù)較少，相關(guān)隨訪資料正在完善中，對LMVD與膽囊癌關(guān)系的研究尚不深入，仍需開展更進一步及更大規(guī)模的研究以證明LMVD在膽囊癌研究中的臨床意義及判斷預后的價值。

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R735.8

B

1671－7783（2014）02－0169－03

10.13312／j.issn.1671-7783.y130270

*：通訊作者，主任醫(yī)師，碩士生導師，E-mail：dinghouzhong＠163.com

2013－12－05 ［編輯］ 何承志