李 巖 姬明禮 李 兵

李巖:女，碩士，講師

緊密連接是細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)中位于上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞最頂端的蛋白復(fù)合體，由閉鎖蛋白(occludin)、claudins 和連接黏附分子(JAMs)等膜蛋白以及緊密黏連蛋白等胞漿蛋白組成，呈連續(xù)串珠狀連接相鄰的細(xì)胞，而起主要連接作用的是前二者，尤以claudins 的功能最為重要，它是構(gòu)成緊密連接的主要骨架蛋白。目前普遍認(rèn)為，細(xì)胞間黏附力喪失可導(dǎo)致細(xì)胞連接的破壞，與腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移有關(guān)。近年研究報道，claudin 蛋白的異常表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)［1］。食管癌是消化道常見惡性腫瘤之一，分子生物學(xué)研究表明，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是多階段、多基因參與、多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的過程，涉及一系列病理生理反應(yīng)，包括細(xì)胞的異常增殖、黏附、運(yùn)動、細(xì)胞外基質(zhì)降解、血管生成等［2］。我們檢測了食管癌組織及健康食管組織中claudin-3、claudin-4、claudin-7、claudin-10 的表達(dá)，以探討其對食管癌浸潤及轉(zhuǎn)移的影響。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2011～2013年在某院食管癌術(shù)后病理標(biāo)本共62例，男41例，女21例。年齡28～76 歲，中位年齡59 歲。均為鱗狀細(xì)胞癌。均經(jīng)病理檢查確診，術(shù)前均未進(jìn)行過放化療及其他生物學(xué)治療。另取20例經(jīng)病理檢測為非食管癌的食管組織作為對照組。

1.2 方法 claudin-3、claudin-4、claudin-7、claudin-10兔多克隆抗體、DAB 試劑盒、免疫組化檢測試劑、其他試劑均為國產(chǎn)分析純。所有標(biāo)本經(jīng)10%的中性甲醛固定24 h，常規(guī)脫蠟后，在檸檬酸鹽緩沖液中抗原高溫修復(fù)20 min。用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min 1 次，連續(xù)3 次;3% H2O2室溫下孵育10 min，用PBS 沖洗2 min 1 次;連續(xù)3 次，然后分別加入claudin-3、claudin-4、claudin-7、claudin-10 抗體4 ℃放置8 h 以上。用PBS 沖洗2 min 1 次，連續(xù)3 次，滴加pv-9000試劑(聚合物輔助劑)20 min 后，用PBS 沖洗(2 min ×3 次)，滴加pv-9000 試劑二(辣根酶標(biāo)記山羊抗兔/小鼠IgG 多聚體)20 min后用PBS 沖洗2 min 1 次，連續(xù)3 次，滴加DAB 液染色5 min，蒸溜水沖洗，蘇木素復(fù)染5 min，鹽酸乙醇脫色2 s，氨水中返藍(lán)1 min，常規(guī)脫水，中性樹膠封片。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn) claudin-3、claudin-4、claudin-7、claudin-10 以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。以陽性細(xì)胞所占比例(5 個高倍視野)分級。(-)為陰性表達(dá);(+)為陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用兩獨(dú)立樣本的χ2檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 兩組病理標(biāo)本claudin-3、claudin-4、claudin-7、claudin-10 陽性表達(dá)率比較(表1，表2)

表1 兩組病理標(biāo)本claudin-3、claudin-4、claudin-7、claudin-10 的陽性表達(dá)率比較例(%)

2.2 食管癌患者claudin-3、claudin-4、claudin-7、claudin-10的表達(dá)與臨床病理特征(表2)

表2 食管癌患者claudin-3、claudin-4、claudin-7、claudin-10 的表達(dá)與臨床病理特征(例)

表1，表2可以看出，claudin-3、claudin-7、claudin-10在食管癌組織中陽性率高，正常食管上皮組織陽性率低。食管癌陽性率較正常食管上皮明顯升高;且癌組織中claudin-3、claudin-7、claudin-10 的表達(dá)均與其分化程度相關(guān)，并隨分化程度升高，陽性率明顯升高。而在食管癌組織中伴有claudin-4 的表達(dá)下調(diào)，低分化組中claudin-4 的表達(dá)明顯低于中- 高分化組。同時可以分析出，食管癌組織中claudin-3、claudin-7、claudin-10 的陽性表達(dá)呈正相關(guān);而claudin-3、claudin-7、claudin-10 的表達(dá)均與claudin-4 呈負(fù)相關(guān)。

3 討 論

正常分化組織的細(xì)胞組成是高度有序的，癌組織則通常缺乏這種特性，腫瘤細(xì)胞常常是分化變差、細(xì)胞極性消失及胞間緊密連接功能失常。緊密連接完整性的破壞可能是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)因子及其他因子擴(kuò)散的原因。食管鱗癌的發(fā)生通常經(jīng)歷從正常食管上皮-食管炎-異型增生-食管癌的系列演變過程［2］。緊密連接是維持上皮細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要結(jié)構(gòu)，claudin 蛋白是緊密連接結(jié)構(gòu)與功能的重要組成成分。癌組織形成的主要特征是緊密連接的破壞、黏附性消失、細(xì)胞獲得侵襲性和正常分化的缺失。不同的claudin成員以多種組合方式參與構(gòu)成緊密連接，增加了緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能的多樣性，為不同組織類型屏障功能的多樣性提供了分子基礎(chǔ)。claudin 在多種上皮來源的腫瘤中表達(dá)異常，推測其在這些腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中可能發(fā)揮一定的作用［1］。

本研究發(fā)現(xiàn)claudin-3、claudin-7、claudin-10 在食管癌中的陽性表達(dá)率為分別為90.3%、95.5%、82.3%，較正常食管組織表達(dá)顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，提示claudin-3、claudin-7、claudin-10 蛋白過表達(dá)可能是食管癌發(fā)生的早期表現(xiàn)，可能與食管癌的發(fā)生有關(guān)，而且其表達(dá)程度與食管癌的分化程度呈正相關(guān)，因此又可以作為食管癌發(fā)展情況的分析指標(biāo)。而claudin-4 與claudin-3、claudin-7、claudin-10 在正常組織和食管癌組織中均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。另有研究表明隨著claudin-4的表達(dá)減低，腫瘤的侵襲性不斷增強(qiáng)。伴有claudin-4表達(dá)陰性患者的5年生存率明顯低于表達(dá)陽性患者［3-4］。因此可以結(jié)合以上任一兩組claudin 的表達(dá)情況，為臨床診斷提供參考。

Claudin 蛋白及其他緊密連接蛋白的表達(dá)異常目前已被認(rèn)為是細(xì)胞間黏附性丟失的機(jī)制和腫瘤細(xì)胞發(fā)生及轉(zhuǎn)移的重要步驟，而這些步驟又可能在癌細(xì)胞的凝聚力降低、分化變差及侵襲性增加的過程中發(fā)揮了重要作用［5］。本研究結(jié)論提示深入開展這方面的研究有可能為食管鱗癌的抗轉(zhuǎn)移治療開辟一條新的途徑。

［1］ 徐 冬.Claudin 蛋白與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.實(shí)用臨床醫(yī)學(xué)，2010，11(9):130-133.

［2］ Ding L，Lu Z，Lu Q，et al.The claudin family of proteins in human malignancy:a clinical perspective［J］.Cancer Manag Res，2013(5):367-375.

［3］ Lee KW，Lee NK，Kim JH，et al.Twist1 causes the transcriptional repression of claudin-4 with prognostic significance in esophageal cancer［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，423 (3):454-460.

［4］ Xiang RL，Su YC，Pei XQ.Progress in functions of tight junction protein claudin-4［J］.Sheng Li ke Xue Jin Zhan，2012，43(4):310-314.

［5］ Sung CO，Han SY，Kim SH.Low expression of claudin-4 is associated with poor prognosis in esophageal squamous cell carcinoma［J］.Ann Surg Oncol，2011，18(1):273-281.