尹 紅,朱豐海，辛海量

(1.解放軍總醫(yī)院藥品保障中心，北京 100853；2.上海警備區(qū)第五干休所門診部，上海 200336；3.第二軍醫(yī)大學(xué)中醫(yī)系，上海 200433)

刺五加又名五加參、刺拐棒，是五加科植物刺五加[Acanthopanaxsenticosus(Rupr. et Maxim.)Harms]的根和根莖，在我國歷代本草典籍中多有記述?！侗静菥V目》載刺五加“補(bǔ)中益氣，堅(jiān)筋骨，強(qiáng)意志，久服輕身耐老”。該藥性溫，味辛、微苦，無毒，入脾腎經(jīng)；能扶正固本、補(bǔ)腎健脾、益智安神；主治脾腎陽虛，腰膝酸軟，體虛乏力，失眠，多夢，食欲不振。近年來，國內(nèi)外學(xué)者經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)，證實(shí)刺五加含有多種活性成分，如酚苷、多糖、氨基酸等[1,2]。藥理作用研究表明，刺五加可增強(qiáng)機(jī)體非特異性防御能力，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射損傷及抗疲勞等作用，可治療神經(jīng)衰弱、糖尿病和心腦血管疾病等[2]，其對(duì)慢性疲勞綜合征的作用是目前研究的熱點(diǎn)之一。本研究觀察刺五加根提取物[Acanthopanaxsenticosus(Rupr.et Maxim.) Harms extract, ASE]的抗慢性疲勞(chronic fatigue,CF)作用及對(duì)CF大鼠下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA)軸的影響，探討其抗疲勞機(jī)制。

1 材 料

1.1 動(dòng)物 將健康普通級(jí)雄性SD大鼠30只，體重(200±20) g[購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK-(軍)2010-081]。將大鼠分籠喂養(yǎng)，自由飲食，在室溫23～28 ℃，濕度40%～70%的動(dòng)物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，照明時(shí)間隨同自然變化。

1.2 藥品和試劑 刺五加根提取物(ASE，AS204856)，主要成分是刺五加苷B+E，為棕黃色粉末(寧波金艾農(nóng)生物科技有限公司)。促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)、皮質(zhì)酮、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放素(corticotropin releasing hormone，CRH)放射免疫試劑盒(上海市生物制品研究所放免室)；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司)。PCR所需試劑和抗體(Biotech)信息見下文方法描述。其他試劑均為市售分析純。

1.3 儀器 Bio-Rad MyIQ5實(shí)時(shí)(real time)PCR (RT-PCR)儀，WFZ UV-2800H紫外分光光度計(jì)(尤尼柯上海儀器有限公司)；1-15K型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海安亭儀器廠)。

2 方 法

2.1 動(dòng)物分組及給藥 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，大鼠按照體重分層隨機(jī)分為5組：對(duì)照組、CF組和ASE 50、100、200 mg/kg組， 每組6只。 5周適應(yīng)性訓(xùn)練后開始給藥， 分別灌胃給予生理鹽水、 生理鹽水和ASE 50、100、200 mg/kg，灌胃容積均為0.8 ml/kg。每天給藥1次，共21 d。

2.2 CF大鼠模型的建立 除對(duì)照組6只大鼠外，其余24只大鼠均先于動(dòng)物跑臺(tái)上進(jìn)行5周適應(yīng)性訓(xùn)練：每天訓(xùn)練20 min，跑臺(tái)的坡度為0度，跑速每周遞增，依次為15、22、27、31、35 m/min，每周訓(xùn)練6 d。然后進(jìn)行3 周的大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練，每天訓(xùn)練35 min， 坡度為0，速度為35 m/min。訓(xùn)練共8周[3]。力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)為動(dòng)物跟不上預(yù)定速度，大鼠臀部壓在籠具后壁，后肢隨轉(zhuǎn)動(dòng)皮帶后拖達(dá)30 s，毛刷刺激驅(qū)趕無效，四肢無力支持住身體、頭部低垂、電刺激后不能繼續(xù)正常奔跑。行為特征為呼吸深急、幅度大、精神疲倦，俯臥位垂頭，刺激后無反應(yīng)。

2.3 取材 訓(xùn)練第8周末稱大鼠體重并進(jìn)行跑臺(tái)力竭實(shí)驗(yàn)，分別記錄各組跑至力竭的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)立即用乙醚輕度麻醉，眼眶取血6 ml，4 ℃靜置30 min后，1.2×103×g離心15 min，分離上層血清。采血后迅速斷頭，鼠頭放在冰盤上分離大鼠下丘腦，于液氮灌中速凍，并于-80 ℃冷藏備用。

2.4 檢測方法

2.4.1 CRH、ACTH和皮質(zhì)酮的血濃度的測定 應(yīng)用放射免疫分析法測定，由北京福瑞生物工程公司協(xié)助測定。

2.4.2 RT-PCR檢測促腎上腺皮質(zhì)激素釋放素受體1(corticotropin releasing hormone receptor 1，CRHR1) mRNA 取下丘腦組織放入1.5 ml的Eppendorf離心管內(nèi)，加入300 μl的Trizol，按RNA抽提試劑盒說明書操作，提取組織總RNA備用(吸光度A260/280在1.8左右，表明RNA分子完整)。按M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，并以cDNA為模板，采用熒光定量試劑盒SYBR Primer Script PCR Kit進(jìn)行PCR反應(yīng)，CRHR1和內(nèi)參物還原磷甘油醛脫氫酶(reduced glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)引物、產(chǎn)物大小、退火溫度及循環(huán)數(shù)見表1。根據(jù)產(chǎn)物擴(kuò)增曲線、CT值(表示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))、 熔解曲線分析擴(kuò)增效率， 優(yōu)化反應(yīng)條件， 最終確定為： 取1∶5稀釋的cDNA 2 μl，加入2×SYBR Premix ExTaq 12.5 μl，上、下游引物各1 μl(終濃度10 μmol/L)， 去離子水8.5 μl， 總反應(yīng)體系 25 μl。RT-PCR反應(yīng)條件，采用2復(fù)孔進(jìn)行反應(yīng)；預(yù)變性：95 ℃ 10 min，變性：95 ℃ 10 s，熔解溫度(Tm) 40 s，共40 個(gè)循環(huán)；延伸：95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。從Tm到95 ℃每上升0.5 ℃取一次熒光值，最后生成熔解曲線，確定反應(yīng)產(chǎn)物的單一性。圖像定量分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到與每個(gè)樣本CT值對(duì)應(yīng)的模板中目的基因的濃度，結(jié)果用目的基因與內(nèi)參(GAPDH)的相對(duì)表達(dá)量表示。

表1 引物序列和實(shí)驗(yàn)條件

3 結(jié) 果

3.1 ASE對(duì)CF大鼠力竭時(shí)間的影響 用藥后，CF組，ASE 50、100、200 mg/kg給藥組大鼠運(yùn)動(dòng)的力竭時(shí)間依次為(72.2±1.72)、(77.4±4.92)、(84.0±4.86)、(96.4±3.61) min，與CF組比較，100、200 mg/kg ASE組大鼠的力竭時(shí)間明顯延長，差異有顯著意義(P<0.01)。說明ASE可有效延長CF大鼠的力竭時(shí)間，有明顯的抗疲勞作用。

3.2 ASE對(duì)CF大鼠ACTH、CRH、皮質(zhì)酮血清濃度和下丘腦CRHR1mRNA表達(dá)的影響 ASE對(duì)CF大鼠ACTH、CRH、皮質(zhì)酮血清濃度和下丘腦CRHR1mRNA表達(dá)的影響見表2。由表2可見，與對(duì)照組相比，CF組大鼠血清ACTH、CRH和皮質(zhì)酮的含量均有明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。ASE 50、100、200 mg/kg組大鼠血清ACTH、皮質(zhì)酮、CRH含量與CF組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

RT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示，CRHR1mRNA 引物擴(kuò)增CT值為18.59～30.73，熔解曲線分析特異性產(chǎn)物Tm值為(52±1) ℃，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.998。GAPDH引物擴(kuò)增CT值為13.28～24.88，熔解曲線分析特異性產(chǎn)物Tm值為(58±1) ℃，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)0.999 4。從表2可見，CF組大鼠下丘腦CRHR1mRNA的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較，有明顯增加(P<0.01)；ASE 50、100、200 mg/kg可有效抑制CF引起的CRHR1mRNA水平的升高(P<0.05,P<0.01)。

表2 刺五加提取液對(duì)慢性疲勞大鼠ACTH、CRH、皮質(zhì)酮血清濃度和下丘腦CRHR1 mRNA表達(dá)的影響

Table 2 Effects of ASE on serum levels of ACTH, CRH, corticosterone and the expression of CRHR1 mRNA in chronic fatigue rats

表2 刺五加提取液對(duì)慢性疲勞大鼠ACTH、CRH、皮質(zhì)酮血清濃度和下丘腦CRHR1 mRNA表達(dá)的影響

**P<0.01，與對(duì)照組比較；△P<0.05，△△P<0.01，與慢性疲勞組比較；ASE：刺五加提取液；ACTH：促腎上腺皮質(zhì)激素；CRH：促腎上腺皮質(zhì)激素釋放素；CRHR1：促腎上腺皮質(zhì)激素釋放素受體1；GAPDH：還原磷甘油醛脫氫酶

組別ACTH(ρB/pg·ml-1)CRH(ρB/ng·ml-1)皮質(zhì)酮(ρB/ng·ml-1)CRHR1mRNA/GAPDH對(duì)照組21．90±1．00 6．79±0．60 284．39±3．20 1．00±0．16慢性疲勞組30．49±2．20＊＊14．16±1．17＊＊370．10±21．39＊＊1．80±0．56＊＊刺五加提取液50mg/kg組22．74±1．12△△10．24±1．52 267．36±4．98△△1．65±0．27△刺五加提取液100mg/kg組17．76±1．02△△6．40±0．05△△248．45±1．31△△1．50±0．18△△刺五加提取液200mg/kg組18．67±0．89△△6．21±0．47△△291．58±5．03△△1．20±0．21△△

4 討 論

應(yīng)激與慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrome, CFS) 的發(fā)生是目前研究的熱點(diǎn)，眾多研究發(fā)現(xiàn)CF在CFS的發(fā)病中起了重要的作用[4]。精神應(yīng)激，精神、心理壓力，長期的腦力、體力勞動(dòng)過度，負(fù)性生活事件，不良生活習(xí)慣等都可能使機(jī)體產(chǎn)生慢性應(yīng)激反應(yīng)，然后引起機(jī)體免疫系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌等多系統(tǒng)的功能紊亂，最終導(dǎo)致以疲勞為主要表現(xiàn)的多組織、器官功能紊亂的CFS相關(guān)癥狀。HPA軸是機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)通路，當(dāng)有應(yīng)激發(fā)生時(shí)，此信號(hào)通過神經(jīng)的傳導(dǎo)進(jìn)入機(jī)體的大腦皮層和邊緣系統(tǒng)，整合后的信號(hào)再傳入到下丘腦，合成、分泌CRH；CRH再通過垂體門脈血流到達(dá)垂體，在這里與相應(yīng)的受體結(jié)合，刺激垂體分泌ACTH；ACTH再經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)腎上腺，在腎上腺與相應(yīng)的受體結(jié)合后刺激腎上腺皮質(zhì)合成和分泌糖皮質(zhì)激素[5]。在正常機(jī)體中，當(dāng)ACTH和糖皮質(zhì)激素升高時(shí)，可反饋抑制CRH和ACTH的分泌，但在發(fā)生應(yīng)激時(shí)，上述反饋抑制作用大大減弱，從而出現(xiàn)ACTH和皮質(zhì)酮的分泌高峰，導(dǎo)致HPA軸功能的亢進(jìn)。若應(yīng)激持續(xù)存在，則可以出現(xiàn)下丘腦、垂體、腎上腺的重量改變及其功能的異常[6]。大多數(shù)的CFS病人在發(fā)病前存在長期的體力或情感的應(yīng)激，這種應(yīng)激狀態(tài)引起HPA軸功能的亢進(jìn)，使得糖皮質(zhì)激素和其他激素釋放增加，這些激素量的增加會(huì)改變機(jī)體多系統(tǒng)的功能狀態(tài)，進(jìn)而影響行為方式，最終出現(xiàn)疲勞、焦慮、記憶力減退等CFS的臨床癥狀[7，8]。

ASE明顯延長了大鼠跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)時(shí)間，延緩了大鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞的發(fā)生。這一結(jié)果可能與ASE含有多種活性成分有關(guān)，可降低血清CRH、ACTH、皮質(zhì)酮的激素水平，從而抑制了大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)造成大鼠體內(nèi)激素分解代謝持續(xù)增加，抑制了HPA軸亢奮有關(guān)。為了進(jìn)一步闡明ASE對(duì)HPA軸的調(diào)節(jié)作用，作者還測定了其對(duì)下丘腦CRHR1mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，ASE調(diào)節(jié)抑制CF大鼠HPA功能亢進(jìn)，可能與其下調(diào)CRHR1mRNA的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)了與CRHR1偶聯(lián)的信號(hào)通路有關(guān)。本研究為進(jìn)一步探索ASE抗慢性應(yīng)激疲勞的下丘腦上行調(diào)控機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)，對(duì)運(yùn)動(dòng)能力的提高有重要意義，也為刺五加防治現(xiàn)代流行疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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