譚強，趙文博，李朋婭，王夢醒，楊春華，劉馨，黃鳳娟，譚慧華，于永忠

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術學院；3.繼光實驗學校）

羊口瘡是由羊傳染性膿皰病毒（Orf virus，ORFV）引起羊屬動物的一種急性、高度接觸性傳染病。其病原體不僅感染羊只，還感染海豹、紅松鼠、馴鹿等野生動物以及部分密切接觸的人員[1-3]。該病多發(fā)生于春秋季節(jié)，通常呈區(qū)域群發(fā)性，主要危害3～6月齡的羔羊和成年羊。研究發(fā)現(xiàn)，病毒主要通過破損的皮膚、粘膜感染皮膚棘細胞層，多存在于膿皰和痂皮內(nèi)。感染部位的皮膚粘膜出現(xiàn)增生性病變。常發(fā)生于唇部感染導致病羊采食困難，形體消瘦，抵抗力降低，進而誘發(fā)壞死性肺炎、敗血癥等疾病導致患畜死亡，給養(yǎng)羊業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。此病由來已久，多發(fā)于澳大利亞、新西蘭等養(yǎng)羊業(yè)發(fā)達的國家，受全球化的影響，該病全球流行趨勢愈發(fā)嚴重[4]。我國最早于1955年報道羊口瘡病。近年來，西藏、新疆、甘肅、內(nèi)蒙、吉林、陜西、四川和云南等多個省區(qū)均有該病發(fā)生和流行的報道。黑龍江也有羊口瘡病的發(fā)生，最近一次報道是在2013年[5]。

單克隆抗體較常規(guī)免疫血清具有高度的同質性和特異性等優(yōu)點，成為檢測病原和抗體的最佳生物探針。加之，單抗可以大規(guī)模批量生產(chǎn)，且易于標準化，將其運用于酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）診斷，將大大提高診斷的特異性，因此利用單抗建立ELISA 診斷試劑盒具有很好的應用前景。B2L 基因編碼大小約42 kDa 的囊膜蛋白，該蛋白是病毒主要的免疫原性蛋白，可刺激機體產(chǎn)生強烈的抗體反應[6]。研究利用一株抗B2L 囊膜蛋白的單抗進行間接免疫熒光試驗，結合病毒培養(yǎng)和聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）鑒定技術，旨在驗證該單抗是否具有識別病毒的能力，為羊口瘡病毒ELISA 檢測試劑盒的研制打下基礎。

1 材料和方法

試驗于2013年4月至2014年2月在黑龍江八一農(nóng)墾大學生命學院動物病毒學研究室完成。

1.1 材料

1.1.1 病毒、細胞和單抗

ORFV（OV/HLJ/04 株）由黑龍江八一農(nóng)墾大學生命學院動物病毒學研究室于2012年6月分離鑒定并保；原代牛睪丸細胞由黑龍江八一農(nóng)墾大學生命學院4061 病毒實驗室保存；單克隆抗體2E4 保存于-70 ℃。

1.1.2 主要試劑

TIANamp Virus DNA/RNA Kit（離心柱型）購自天根公司；Dream TaqTM Green PCR Master Mix 購自Fermenters；引物由金唯智公司合成；FITC 標記山羊抗小鼠IgG（H+L）購自碧云天公司。

1.1.3 主要儀器

LEICA DM2500 多功能顯微鏡購自萊卡公司；Veriti96-Well Thermal Cycler 購自AB 公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒的培養(yǎng)

具體操作步驟：（1）選用生長狀態(tài)良好無細胞病變（cytopathic effect，CPE）的原代BT 細胞，當細胞面積達到視野面積約1/2 時，棄去培養(yǎng)上清，用PBS 沖洗兩次；（2）然后加入毒力滴度為2.75 的病毒液10 μL和990 μL 含2%FBS 的DMEM/HIGH GLUCOSE 維持液，置于37 ℃CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h，搖勻病毒液，使病毒液充分接觸培養(yǎng)皿板底細胞，共4 次，每次間隔30 min，對照組則用維持液替代；（3）然后添加9 mL 的維持液，放入37 ℃CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；（4）每天固定時間觀察記錄細胞狀態(tài)，確定最佳免疫熒光時間；（5）最后棄上清液，回收病變細胞。

1.2.2 間接免疫熒光試驗

具體操作步驟：（1）用無菌蓋玻片覆蓋于培養(yǎng)皿內(nèi)進行BT 細胞的培養(yǎng)，待細胞面積達到視野面積約1/2 時，選2 個培養(yǎng)皿為實驗組，2 個培養(yǎng)皿為對照組。實驗組，按照1.2.1 方法接毒，對照組則用維持液替代；（2）選擇2 d 作為免疫熒光時間，待接毒后2 d后，棄去維持液，用4 ℃預冷的PBS 緩沖液搖洗3次，每次5 min；（3）每平皿加入1 mL 80%的冷丙酮，于4 ℃固定5 min 后，棄去固定液，敞開細胞培養(yǎng)板使其自然干燥；（4）每平皿加入1∶100 稀釋的2E4 單克隆抗體5mL，37 ℃孵育1 h，洗滌同上；（5）然后每平皿加入1∶1 000 稀釋的FITC-山羊抗鼠IgG 抗體5 mL，37 ℃避光孵育1 h，保持避光洗滌，方法同上；（6）最后取出附有細胞的蓋玻片加80%的甘油封片，置熒光顯微鏡觀察[7]。

1.2.3 引物

參考GenBank中的ORFV的標準株NZ2（DQ184476）中的B2L（ORFV011）和F1L（ORFV059）設計兩對的引物，B2L（F）：5’-CGGGATCCATGTGGCCGTTCTCCTC-3’，B2L（R）5’-CCAAGCTTTTAATTTATTGGCTTGCAGAA CT-3’；F1L（F）：5’-CCAAGCTTGCCACCATGTACATA ATCGGGGTTGCC-3’，F(xiàn)1L（R）5’-CCCTCGAGTCACA CGATGGCCGTGACC-3’，引物由金唯智生物公司合成。

1.2.4 病毒DNA 提取

按照TIANamp Virus DNA/RNA 試劑盒操作步驟，對回收的CPE 細胞和病毒原液進行病毒的DNA提取，并將DNA 保存于-20 ℃。

1.2.5 PCR 鑒定

對病毒保守的囊膜基因B2L 和微管蛋白F1L 進行PCR 鑒定，PCR 反應體系如下：ddH2O 4 μL，Green taq 酶5 μL，上、下游引物（10 pmol·L-1）各0.5 μL，模板2 μL，總體積為12 μL。PCR 反應條件為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s；72 ℃延伸80 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取擴增產(chǎn)物10 μL 于含有溴化乙錠的1%（w/v）瓊脂糖凝膠上電泳檢測[8]。

2 結果

2.1 病毒的培養(yǎng)

BT 細胞在接種毒株后，呈現(xiàn)明顯的病理變化。當接種2 d 時，實驗組一些散在細胞出現(xiàn)空泡樣病變，而對照組細胞并未出現(xiàn)任何CPE。當接種3 d 時，實驗組一些細胞逐漸皺縮漂浮，而對照組細胞出現(xiàn)散在漂浮。當接種4 d 時，實驗組細胞大面積皺縮，而對照組同3 d 時相比，細胞外觀無變化。當接種5 d時，實驗組一些皺縮細胞開始陸續(xù)漂浮，而對照組無病理變化。當接種6 d 時，實驗組皺縮的細胞繼續(xù)增多，呈拉網(wǎng)狀病變，且產(chǎn)生CPE 的細胞面積超過總面積1/2，對照組細胞也產(chǎn)生CPE，但病變程度無實驗組顯著，同實驗組接毒細胞3 d 時的病變程度類似。當接種7 d 時，實驗組大量細胞脫離培養(yǎng)皿，已無完整細胞形態(tài)，而對照組此時的細胞形態(tài)與實驗組4 d時的細胞形態(tài)相似。見圖1（A～B）。

圖1（A） 羊口瘡感染BT 細胞流程圖Fig.1（A） The progress of BT caused by ORFV from infection to lysis

圖1（B） 羊口瘡感染BT 細胞流程圖Fig.1（B） The progress of BT caused by ORFV from infection to lysis

2.2 間接免疫熒光試驗

實驗結果表明，對實驗組予以激發(fā)光可見白色箭頭所指處的細胞具有熒光反應（圖2-B），而對照組則無此反應（圖2-D）；在白光條件下觀察實驗組細胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)結合熒光抗體的細胞皺縮成團（2-A），出現(xiàn)明顯的CPE。

圖2 間接免疫熒光檢測ORFV 在被感染BT 細胞中的分布情況Fig.2 The distribution of ORFV in infected BT cells

2.3 PCR 鑒定結果

PCR 結果表明，反復凍融感染ORFV 的MDBK細胞和BT 細胞獲得的裂解物通過PCR 均擴增出了一條約為1 005 bp 的條帶，其中BT 細胞擴增條帶的亮度明顯高于MDBK。不僅如此，BT 細胞的樣品還擴增出了另一條約為1 035 bp 的條帶，而MDBK 細胞則沒有該條帶。見圖3

圖3 B2L 基因和F1L 基因的PCR 擴增結果Fig.3 PCR amplifications of the B2L gene and F1L gene of parapoxvirus

3 討論

系統(tǒng)地記錄了羊口瘡分離毒株OV/HLJ/04 株感染BT 細胞的表觀變化過程。通過觀察發(fā)現(xiàn)，接種毒株的細胞與未接種毒株的細胞之間存在著一個約3 d 間隔期，即接種的BT 細胞要早于未接種的BT 細胞3 d 發(fā)生病變，初步擬定進行免疫熒光的時間在1～2 d，本研究選擇2 d 作為免疫熒光試驗的最佳時間，在已獲得的B2L 單抗基礎上進行熒光實驗。單抗具有特異性識別抗原位點的能力，可用于識別病毒表面的B2L 囊膜蛋白，從而達到識別和定位病毒的目的。免疫熒光試驗結果表明，單克隆抗體2E4具有識別ORFV 的功能。

ORFV 的B2L 蛋白既是研究病毒與宿主免疫系統(tǒng)相互作用的靶蛋白，也是病毒重要的結構蛋白。該蛋白誘導的免疫反應能抵抗強毒攻擊[9]，刺激淋巴細胞釋放。目前對B2L 的研究主要集中于進化樹分析，張克山[10]于2010年首次在國內(nèi)利用B2L 基因全序列對病毒進行進化樹分析，發(fā)現(xiàn)分離的羊口瘡湖北株CHINA/Goat/2009 與臺灣的Nantou（DQ934351）株和韓國的Hoping（EU935106）株親緣性較近。B2L基因由于具有保守性不僅用于進化樹分析，還用于病毒的鑒定。對保守基因B2L 進行PCR 鑒定是目前鑒別羊口瘡病毒的一種有效檢測手段。PCR 結果表明，感染的MDBK 細胞和BT 細胞均含有羊口瘡病毒，但感染的MDBK 所擴增的條帶不清晰，且未能擴增出目的條帶B2L 基因，可能與病毒在MDBK 細胞內(nèi)的毒力低有關[11]。前期利用MDBK 增殖病毒，發(fā)現(xiàn)分離毒株無法適應MDBK，導致接種失敗，同時也暗示著ORFV 對兩種細胞的易感性不同。

ORFV 感染宿主后引起患處上皮細胞病變，研究MDBK 細胞以及人羊膜上皮細胞在ORFV 作用下的病變情況[12]，對于研究病毒的致病機制將起到積極的作用。病毒在進化過程中，捕獲一系列免疫調(diào)節(jié)和致病性相關基因，通過各種表達產(chǎn)物限制宿主的免疫清除效應，達到庇護種群增殖和病毒粒子成熟的目的[13]。目前，ORFV 分布范圍廣，對養(yǎng)殖業(yè)危害大。因此臨床上建立一種重復性好、可操作性強的診斷方法很有必要。利用B2L 單抗建立快速、便捷的羊口瘡ELISA 診斷方法，具有很高的應用價值。

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