鐘其頂，武竹英，仇 凱，王道兵，程 濤，熊正河,，王 明，尹大寬，李 令

(1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015；2.全國食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心，北京 100015；3.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川 瀘州 646000)

高粱是人類栽培的重要谷類作物和釀酒原料之一，在我國被廣泛種植。隨著人們對食品的健康和營養(yǎng)價(jià)值的重視，有機(jī)產(chǎn)品倍受歡迎，諸如有機(jī)白酒之類的高附加值的高粱產(chǎn)品也應(yīng)運(yùn)而生。然而，有機(jī)農(nóng)業(yè)的產(chǎn)量低，總生產(chǎn)成本卻較常規(guī)農(nóng)業(yè)高[1]，在利益驅(qū)使下，一些不法種植者在種植過程中添加化肥或農(nóng)藥來提高產(chǎn)量或降低人工成本，采收后打著“有機(jī)產(chǎn)品”的幌子，以高于常規(guī)農(nóng)產(chǎn)品幾倍甚至十幾倍的價(jià)格銷售，這種行為嚴(yán)重?fù)p害了誠實(shí)的有機(jī)農(nóng)產(chǎn)品種植者和食品企業(yè)的利益。

有機(jī)農(nóng)產(chǎn)品與常規(guī)農(nóng)產(chǎn)品最大的區(qū)別是在原料生長過程中不使用化肥和農(nóng)藥。我國現(xiàn)行的農(nóng)藥殘留檢測方法已經(jīng)比較成熟，可以檢測農(nóng)產(chǎn)品表面或內(nèi)部的微量農(nóng)藥殘留；而對于是否使用化肥，尚無有效的檢測方法。氮元素是植物中最主要的組成元素之一，主要來自于植物所用的肥料，不同來源的肥料，氮同位素組成不同，而施用不同氮肥也會(huì)導(dǎo)致植物的氮穩(wěn)定同位素組成不同。國外已有研究證明，有機(jī)作物和常規(guī)作物的氮穩(wěn)定同位素差異顯著，氮同位素組成可作為鑒別有機(jī)和常規(guī)農(nóng)產(chǎn)品的潛在指標(biāo)[2]。

本工作通過設(shè)計(jì)有機(jī)肥組、化肥組、混合組、空白組4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分析肥料種類對高粱植株和果實(shí)中δ15N值的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

元素分析-穩(wěn)定同位素質(zhì)譜聯(lián)用儀(EA-IRMS)：美國Thermo-Fisher公司產(chǎn)品；烘箱：上海一恒科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

高粱果實(shí)為國窖紅1號(hào)有機(jī)高粱；有機(jī)肥為市售商品有機(jī)肥；化學(xué)合成氮肥為市售尿素。

高粱種植于京郊某農(nóng)場中，按施肥方式分為4組：有機(jī)肥組(僅施有機(jī)肥)、混合組(以純氮計(jì)，有機(jī)肥、化肥各半)、化肥組(僅施化肥)和空白組(不施任何外源肥)，詳細(xì)情況列于表1。各組所用有機(jī)肥和尿素的含氮量分別為2%和46%。除施肥種類不同外，其他管理?xiàng)l件均一致，并符合有機(jī)農(nóng)業(yè)管理要求。待高粱成熟后，收集果實(shí)測定其氮同位素組成，每組取3個(gè)平行樣品進(jìn)行研磨測定。

表1 各組中肥料種類和施肥量Table 1 Fertilizer type and fertilization in different treatments

從瀘州某有機(jī)高粱研究基地選4塊土地種植高粱，任意兩塊之間間隔10 m以上，分別施加商品有機(jī)肥、農(nóng)家肥、化肥和空白種植(不施任何外源肥)。并從瀘州地區(qū)的大田中收集不同品種的有機(jī)和常規(guī)高粱果實(shí)，分別測定這些高粱果實(shí)中的氮同位素組成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣品的前處理 將高粱果實(shí)于65 ℃下烘干至恒重，用粉碎機(jī)將其粉碎，再用研缽將其研磨成60目以下的粉末。植物樣品的稱樣量要求其形成的N2離子流強(qiáng)度應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)參考?xì)獾碾x子流強(qiáng)度線性范圍之內(nèi)，因此，需要根據(jù)不同植物樣品中的氮含量以及被測氣體進(jìn)入IRMS 所產(chǎn)生的離子流強(qiáng)度大小來確定樣品的稱樣量。根據(jù)以上原則，稱取適量樣品，用錫杯包好，待測。用錫杯包裹樣品時(shí)，要排盡空氣，避免空氣中的氮?dú)鈱悠窚y定造成干擾。經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，高粱的取樣量為3.00～5.00 mg時(shí)，信號(hào)強(qiáng)度符合要求。

1.3.2高粱的穩(wěn)定同位素分析方法 EA-IRMS分析系統(tǒng)主要由3部分組成：配有自動(dòng)進(jìn)樣器的Flash EA 2000 型元素分析儀；連續(xù)流接口裝置ConfloⅣ；Thermo-Finnigan DELT Aplus XP 穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜儀。Flash 2000型元素分析儀由氧化爐、還原爐、吸水柱、分離柱等部分構(gòu)成[3]。當(dāng)用錫杯包裹的樣品通過自動(dòng)進(jìn)樣器送入氧化爐后，樣品在過氧環(huán)境中瞬間高溫分解，形成碳、氮、氧、硫各成分的混合氣體在高純氦氣(純度為99.999%) 的運(yùn)載下依次通過還原爐、吸水柱和分離柱進(jìn)入Conflo 裝置。在此過程中，氮的各類氧化物在還原爐中被轉(zhuǎn)化為N2，并通過色譜柱與其他氣體分離， 經(jīng)過ConfloⅣ整流后被送入質(zhì)譜儀。以高純氮?dú)?純度為99.999%) 作為參考標(biāo)準(zhǔn)， 測定樣品的氮同位素比值[4]，整個(gè)分析系統(tǒng)的流程圖示于圖1。

圖1 EA-IRMS 分析系統(tǒng)工作流程圖Fig.1 Work process of EA-IRMS

1.4 結(jié)果表示

自然界穩(wěn)定同位素常用豐度來描述，即同位素比值(R=重同位素/輕同位素)。由于穩(wěn)定同位素的自然豐度極小，計(jì)算不方便，因此同位素豐度常通過另一個(gè)單位δ值來表達(dá)。δ值表示樣品的同位素比值相對于標(biāo)準(zhǔn)樣品同位素比值的千分偏差，其計(jì)算公式如下[5]：

δ15Nsample(‰) =

[(Rsample/Rstandard)-1] ×1 000

(1)

式中，Rsample為樣品中15N與14N的比值；Rstandard為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(空氣氮庫)中15N與14N的比值，15N/14N = 0.003 68。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

通過多次實(shí)驗(yàn)，確定了載氣條件、氧噴條件、參考?xì)夂瓦M(jìn)樣量大小、EA系統(tǒng)溫度等參數(shù)。最終優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件為：氧化爐溫度980 ℃，還原爐溫度650 ℃，爐溫60 ℃，離子源真空1.8×10-4Pa，電壓3.06 kV，進(jìn)樣量約4.00 mg。

2.2 北京地區(qū)不同種植組的高粱δ15N值

京郊實(shí)驗(yàn)田中各組高粱的δ15N值示于圖2。由圖2可見，有機(jī)肥組的高粱δ15N值顯著高于化肥組樣品，這主要是由于不同氮源的肥料施入所造成的。例如，大氣氮的δ15N值約為0‰；土壤有機(jī)氮δ15N值大于大氣氮，約為3‰[6-8]；化肥中氮δ15N值約為-2～0‰；而畜肥δ15N值約為10～20‰[9-11]。由于大氣氮池是全球最大的氮池，經(jīng)過了千萬年的沉積，大氣氮δ15N值不會(huì)在短時(shí)間內(nèi)隨時(shí)間或空間發(fā)生較大的變化[12]?；师?5N值接近于空氣，是由于化學(xué)合成的氮肥中的氮來自于空氣，而在化學(xué)合成過程中，同位素分餾較小，且14N較15N更容易反應(yīng)，因此合成氮肥的氮同位素組成略低于空氣[13-15]。 由于15N的富集，植物體內(nèi)的15N豐度高于空氣中的，當(dāng)作物被再利用時(shí)(如漚肥、作為動(dòng)物飼料)，15N會(huì)進(jìn)一步發(fā)生富集[16]。本研究中，不同肥料的施入導(dǎo)致不同的氮源被植物吸收，造成植物δ15N值差異。

圖2 北京地區(qū)不同種植組的高粱δ15N值Fig.2 δ15N values of sorghum in different treatments in Beijing

不同種植組中，有機(jī)肥組的高粱δ15N 值和對應(yīng)的空白組樣品的δ15N 值差異較小，這是由于在缺氮情況下，植物對氮的吸收機(jī)制與氮源充足時(shí)不同，此時(shí)的植物更容易富集15N。巨曉棠等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在低施氮量時(shí)，植物吸收的氮素以NO3-形式存在較少，而以NH4+形式存在較多；Choi等[18]研究發(fā)現(xiàn)，樣品中銨態(tài)氮(NH4+-N)的δ15N值比硝態(tài)氮 (NO3--N)的δ15N值高；由這兩個(gè)結(jié)果可以推斷出空白組樣品的δ15N值會(huì)較高，這與本研究的結(jié)果相吻合。不施任何肥料的作物也屬于有機(jī)作物，因此，空白組樣品可以認(rèn)為是有機(jī)樣品，不會(huì)干擾到有機(jī)樣品和常規(guī)樣品的區(qū)分。

2.3 瀘州地區(qū)不同品種和種植方式的高粱δ15N值

收集瀘州地區(qū)的不同高粱樣品進(jìn)行δ15N值的測定。樣品1為商品有機(jī)肥組，樣品2為農(nóng)家肥組，樣品3為化肥組，樣品4為空白組，樣品5、6分別為瀘州兩個(gè)不同地區(qū)的大田生產(chǎn)的國窖紅1號(hào)高粱果實(shí)，樣品7、8為在瀘州地區(qū)收集到的與國窖紅1號(hào)品種不同的兩個(gè)常規(guī)高粱果實(shí)。每個(gè)樣品做3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，測定結(jié)果示于圖3。

圖3 瀘州地區(qū)不同品種和種植方式的高粱果實(shí)δ15N值Fig.3 δ15N values of sorghum in different treatments or varieties in Luzhou

空白組高粱果實(shí)δ15N值略低于有機(jī)肥組，這是由于空白組氮源不足，吸收機(jī)制與其他種植組樣品不同，同時(shí)說明樣品δ15N值與含氮量的關(guān)系不大。與京郊實(shí)驗(yàn)田中的樣品相同，瀘州國窖紅1號(hào)樣品中，有機(jī)肥組(包括商品有機(jī)肥組和農(nóng)家肥組)和空白組的高粱果實(shí)δ15N值均高于化肥組。大田中收集的有機(jī)高粱樣品5的δ15N值略低于其他有機(jī)樣品，這可能是由于所用的肥料為植物秸稈類有機(jī)肥，其本身的δ15N值偏低。樣品3、樣品7和樣品8雖然同為施化肥樣品，但δ15N值差異較大，可能是由肥料差異和作物品種差異所造成的。Yoneyama等[19]分別對3種不同品種的甜薯和甜高粱進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)同種作物不同品種間的差異很小，由此可排除品種差異。那么，可能的原因是樣品7和樣品8是在常規(guī)種植區(qū)域采集的樣品，常規(guī)種植區(qū)長期使用化肥；而樣品3的種植地是在瀘州有機(jī)高粱研究區(qū)域開辟出來的實(shí)驗(yàn)田，該區(qū)域以往幾年均種植有機(jī)高粱，土壤中有多余的未被植物吸收的殘留有機(jī)肥，在樣品生長過程中會(huì)逐漸釋放肥效。因此，樣品3的δ15N值會(huì)明顯高于樣品7和樣品8。

不論是京郊實(shí)驗(yàn)田的樣品還是瀘州地區(qū)的樣品，不論品種是否相同，本研究中所有施化肥的樣品δ15N值均低于施有機(jī)肥的樣品δ15N值，尤其對于同種植物來說，有機(jī)樣品和常規(guī)樣品δ15N值差異更明顯。因此，在有機(jī)監(jiān)管過程中，δ15N值檢測雖然不能替代其他檢測，但可以作為追蹤植物施肥情況的一個(gè)重要參考要素。

3 結(jié)論

本研究通過對有機(jī)和常規(guī)高粱果實(shí)進(jìn)行穩(wěn)定氮同位素分析，發(fā)現(xiàn)使用不同肥料的植物δ15N值明顯不同，有機(jī)高粱樣品的δ15N值均高于常規(guī)樣品，因此，高粱δ15N值可以作為判斷高粱生長過程中施肥情況的參考要素，尤其是對同一品種的農(nóng)作物，δ15N值的參考性更強(qiáng)。所建立的穩(wěn)定同位素技術(shù)對施肥方式的判斷方法，填補(bǔ)了我國從農(nóng)產(chǎn)品追蹤植物施肥情況的技術(shù)空白，可以作為完善有機(jī)農(nóng)產(chǎn)品認(rèn)證的市場監(jiān)管技術(shù)手段；結(jié)合有機(jī)高粱同位素?cái)?shù)據(jù)庫的建立，也可為有機(jī)白酒和其他高粱釀造的白酒的原料質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。

致謝：感謝瀘州老窖股份有限公司在樣品的種植和收集方面給予的幫助。

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