鐘其頂，王道兵，孟 鎮(zhèn)，熊正河，王 敏

(1. 天津科技大學(xué)，天津 300457；2. 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100027；3.全國食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心，北京 100027)

食醋是日常生活中的重要食材之一，根據(jù)工藝不同可分為釀造醋和配制醋，其中釀造醋[1]根據(jù)發(fā)酵原料不同，可以分為糧食醋和水果醋。近年來，果醋飲料由于獨(dú)特的風(fēng)味和保健作用在世界發(fā)達(dá)國家受到歡迎，被稱作“第四代黃金飲品”。在利益驅(qū)動下，部分不法商家通過虛假標(biāo)注食醋來獲取最大市場利益，如將普通食醋虛假標(biāo)注為果醋。因此，需要建立一種食醋原料溯源的分析方法，以推動食醋市場公平競爭，保護(hù)消費(fèi)者利益。

目前，依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的物理化學(xué)等常規(guī)指標(biāo)只能判定食醋的基本質(zhì)量，難以有效溯源食醋的發(fā)酵原料[2-4]。據(jù)報道，產(chǎn)品中碳-13比值(δ13C)與其原料有密切關(guān)聯(lián)，碳同位素技術(shù)已被廣泛用于原料溯源及產(chǎn)品真實性鑒別[5-13]，因此通過測定乙酸中δ13C可溯源食醋的原料來源[14-16]。醋中有機(jī)物除乙酸外，還有多種醇、醛、酯類化合物，為避免受到其他有機(jī)物的影響，測定乙酸中δ13C時需先提純乙酸[16]。目前測定食醋中乙酸δ13C主要有兩種方法：一種是通過微蒸餾系統(tǒng)提純食醋中乙酸[16]，再采用元素分析儀-同位素質(zhì)譜(EA-IRMS)進(jìn)行測定，該方法采用的微蒸餾系統(tǒng)設(shè)備昂貴、操作步驟復(fù)雜，需盡力避免在蒸餾過程中乙酸的碳同位素分餾影響；另一種是利用氣相色譜-燃燒-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜(GC-C-IRMS)測定單體有機(jī)物中碳同位素組成[17]，考慮到食醋中含水量高達(dá)90%以上，且含水量大的樣品不能直接進(jìn)入氣相色譜儀，因此需先采用頂空-固相微萃取技術(shù)[15-16]萃取食醋中乙酸[18-19]，然后用GC-C-IRMS分析測定，但該萃取過程存在同位素分餾作用，且隨著固相微萃取頭使用次數(shù)增加而導(dǎo)致效率降低，進(jìn)而影響測量的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度，因此該方法至今未被推廣應(yīng)用。

擺脫對復(fù)雜前處理步驟的依賴，實現(xiàn)食醋中乙酸的GC直接進(jìn)樣，是利用GC-C-IRMS技術(shù)測定乙酸碳同位素的關(guān)鍵?？紤]到食醋中乙醇含量在1.19～3.37 g/L之間[20]，而乙酸含量高于35 g/L[1]，出于增加樣品中有機(jī)相比例和降低碳同位素測定時信號強(qiáng)度的目的，本研究采用乙醇作為稀釋劑[21]，利用GC-C-IRMS直接測定食醋中乙酸的碳同位素組成。

1 實驗部分

1.1 儀器

Triplus自動進(jìn)樣器，Trace GC氣相色譜儀，燃燒轉(zhuǎn)化裝置，Delta V Advantage穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀(δ13C測定內(nèi)精度≤0.065‰，線性測定范圍2～10 V)：均為美國Thermo-Fisher公司產(chǎn)品。

1.2 試劑

氦氣：純度大于99.999%；乙醇：國產(chǎn)色譜純；冰乙酸：國產(chǎn)分析純，經(jīng)EA-IRMS標(biāo)定得δ13CVPDB= -26.41±0.15‰；果醋：2011年FIT-PTS第2輪國際比對樣品；6種市售食醋和1個工業(yè)醋酸的詳細(xì)信息列于表1。

1.3 色譜條件

Wax毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為氦氣；柱流速1.2 mL/min；進(jìn)樣口溫度300 ℃；升溫程序：起始溫度120 ℃，保持1 min，以15 ℃/min 升溫至200 ℃，保持2 min；進(jìn)樣體積1 μL；分流比20∶1。

1.4 乙酸轉(zhuǎn)化條件

燃燒轉(zhuǎn)化裝置(IsoLink)中配備陶瓷(Al2O3)氧化管(填料為CuO，NiO和Pt)，工作溫度為1 000 ℃，將乙酸轉(zhuǎn)化成CO2。

1.5 樣品前處理

根據(jù)穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀的測定線性范圍(2～10 V)及色譜條件，用乙醇將食醋樣品稀釋至乙酸含量約8 g/L。

表1 市售食醋和工業(yè)醋酸的詳細(xì)信息及乙酸碳同位素數(shù)據(jù)(n=3)Table 1 Details of vinegar samples and acetic acid with isotope ratios measured by GC-C-IRMS(n=3)

注：*原材料代指商品標(biāo)簽所列的原料信息

2 結(jié)果與分析

2.1 保留時間的確定

同位素質(zhì)譜測定乙酸δ13C前，需通過燃燒爐裝置將乙酸轉(zhuǎn)化成CO2，為了避免稀釋用乙醇溶劑進(jìn)入燃燒爐影響乙酸轉(zhuǎn)化率，需要準(zhǔn)確測定乙醇和乙酸在氣相色譜分離中的保留時間；再根據(jù)乙醇溶劑保留時間設(shè)定反吹(backflush)參數(shù)，確保乙醇溶劑全部通過反吹排出。

將乙醇和乙酸的標(biāo)準(zhǔn)品混合物置于頂空進(jìn)樣瓶，取進(jìn)樣瓶上層的乙醇和乙酸混合氣體注入GC-C-IRMS進(jìn)行測定，得到乙醇和乙酸的44、45和46離子流圖，示于圖1。

圖1 GC-C-IRMS測定乙醇和乙酸的44，45和46離子流圖Fig.1 Ions chromatography of acetic acid and ethanol 44,45,46 determinated by GC-C-IRMS

由圖1可見，乙醇與乙酸可有效分離，保留時間分別為309 s和523 s，可設(shè)置在200～400 s期間打開反吹，將乙醇溶劑峰成功排出，從而消除乙醇溶劑對乙酸δ13C測定的影響。

2.2 乙醇稀釋法測定乙酸δ13C準(zhǔn)確性研究

根據(jù)穩(wěn)定同位素測定要求，測定復(fù)雜樣品中某一種組分時，必須通過前處理技術(shù)將待測組分進(jìn)行分離、提純、轉(zhuǎn)化特定氣體(如CO或CO2)，再進(jìn)入穩(wěn)定同位素質(zhì)譜進(jìn)行測定。如前面提及的微蒸餾系統(tǒng)提純食醋中乙酸和固相萃取技術(shù)萃取濃縮食醋中乙酸，均屬于食醋樣品的前處理手段。本研究擬采用乙醇直接稀釋后，經(jīng)毛細(xì)管氣相色譜柱分離提純食醋中乙酸。為了驗證乙醇稀釋前處理技術(shù)的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，模擬配制不同乙酸濃度的水溶液，測定結(jié)果列于表2。

表2 不同濃度乙酸水溶液中乙酸δ13C測定結(jié)果Table 2 δ13C-values of acetic acid in acetic acid-water solution with different contents

注：α=0.05時，t雙尾臨界為2.262 2；P為雙層檢驗概率

從表2可見，5%乙酸溶液中乙酸δ13C的測定結(jié)果穩(wěn)定在-26.28‰～-26.40‰之間，與冰乙酸(δ13C=-26.41‰)十分接近。分別對不同濃度的乙酸溶液同冰乙酸測定值進(jìn)行t檢驗分析，P均大于0.05，說明溶液中乙酸δ13C與冰乙酸的測定值無顯著性差異，因此，該方法可以用來測定濃度為2%～100%的乙酸溶液。

2.3 食醋中乙酸δ13C測定

選擇實際食醋樣品進(jìn)行測定，44、45和46離子譜圖示于圖2。

從圖2可見，食醋樣品的乙酸峰對稱均勻，與其他雜峰明顯分離，避免了未知物質(zhì)對乙酸δ13C測定的干擾。

2.4 穩(wěn)定性

2.4.1重復(fù)性分析 選擇特定食醋樣品，重復(fù)測定10次，驗證該方法的重復(fù)性，結(jié)果列于表3。

圖2 果醋樣品乙酸δ13C分析圖譜Fig.2 Chromatogram of δ13C of acetic acid in fruit vinegar

表3 食醋中乙酸δ13C重復(fù)性測定結(jié)果Table 3 Repeatability of δ13C-values of acetic acid in vinegar

由表3可知，本方法連續(xù)10次測定食醋樣品中乙酸δ13C的標(biāo)準(zhǔn)偏差1σ=0.13‰，不僅滿足文獻(xiàn)[18]所述的純乙酸δ13C穩(wěn)定性的標(biāo)準(zhǔn)偏差σ范圍為0.1‰～0.4‰，而且達(dá)到穩(wěn)定同位素質(zhì)譜精度測試要求小于0.2‰。

2.4.2再現(xiàn)性分析 選擇某食醋樣品為實驗對象，分別置于4個溶劑瓶A、B、C、D中，其中A、B、C和D分別在第1天、第3天、第5天、第7天進(jìn)行測定，結(jié)果列于表4。

結(jié)果表明，該方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.05‰，再現(xiàn)性較好，能滿足重復(fù)測定的要求(小于0.2‰)。

2.5 準(zhǔn)確性驗證

實驗室在2011年參加由歐盟聯(lián)合研究中心(JRC)支持的穩(wěn)定同位素實驗室間能力驗證計劃(FIT-PTS)。實驗室按照本研究所建立的乙醇溶劑稀釋法結(jié)合氣相色譜-同位素質(zhì)譜(GC/IRMS)測定歐盟郵遞的以水果為原料的食醋中乙酸δ13C，結(jié)果列于表5。

由表5可見，通過不同時間的再現(xiàn)性測試，樣品中乙酸的δ13C均十分穩(wěn)定，平均值為-25.66，不同天數(shù)12次測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.06‰，符合測定要求。本實驗室向歐盟提交了果醋中乙酸δ13C的測試結(jié)果(實驗室編號D6)，并得到了數(shù)據(jù)反饋，列于表6和圖3(除D6外，其余7個實驗室均采用微蒸餾裝置將乙酸從食醋中提純后,再用EA-IRMS進(jìn)行測定)。

表4 食醋中乙酸δ13C再現(xiàn)性測定結(jié)果Table 4 Reproducibility of δ13C-values of acetic acid in vinegar

表5 果醋中乙酸δ13C重復(fù)性測定結(jié)果Table 5 Repeatability of δ13C-values of acetic acid in fruit vinegar

表6 FIT-PTS國際實驗室比對結(jié)果Table 6 Results of FIT-PTS inter-laboratory comparison study

圖3 FIT-PTS項目中果醋樣品乙酸δ13C的標(biāo)準(zhǔn)得分(z-Score)圖Fig.3 z-Score for δ13C of acetic acid in vinegar

由表6和z-score可知，編號為D1、D3和D4的實驗室測定結(jié)果明顯偏離(≤-2σ或≥2σ)，超出正常波動測定范圍。剔除上述3個離散數(shù)據(jù)后，其余數(shù)據(jù)的平均值為-25.83‰，1σ=0.15‰，與本方法測得的結(jié)果相差0.17‰，達(dá)到國際實驗室間比對的能力驗證范圍(小于0.3‰)。通過本次國際間比對實驗說明，當(dāng)前采用微蒸餾提純食醋中乙酸的方法在不同實驗室間仍存在較大偏差，穩(wěn)定性和操作誤差仍有待提高；同時，本研究所建立的GC-C-IRMS方法適用于食醋中的乙酸同位素測定，結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡便快捷。

2.6 食醋樣品分析

應(yīng)用本方法測定表1中列出的市售食醋樣品及工業(yè)醋酸中乙酸δ13C。結(jié)果表明，食醋的原料不同時，乙酸δ13C也有差異，B與C均為米醋，但B中加入了食用醋酸使得乙酸δ13C偏正，該食用醋酸可能由玉米等C3植物發(fā)酵而來；D與E均為老陳醋(3年)，乙酸δ13C不同可能是由于不同產(chǎn)品中原料(配比)不盡相同；G為工業(yè)醋酸，其δ13C最偏負(fù)。由此可知，根據(jù)食醋中乙酸δ13C可溯源其發(fā)酵原料，也可定性鑒別食醋中是否含有工業(yè)醋酸。

3 結(jié)論

采用乙醇作為稀釋溶劑，基于毛細(xì)管氣相色譜柱分離技術(shù)，可在不引起食醋中乙酸碳同位素分餾的情況下進(jìn)行分離純化，通過燃燒爐和穩(wěn)定同位素質(zhì)譜實現(xiàn)對食醋中乙酸δ13C的準(zhǔn)確測定。該方法的精密度和穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確性高、操作簡便快速，適合推廣應(yīng)用，為我國進(jìn)一步規(guī)范食醋和果醋市場提供技術(shù)支撐。

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