鐘其頂，王道兵,，鄭 淼，仇 凱，武竹英，熊正河，黃占斌

(1. 中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100027；2. 全國(guó)食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心，北京 100027；3. 中國(guó)礦業(yè)大學(xué)(北京)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100083)

橙汁是一種廣受全球消費(fèi)者鐘愛的果汁品種，其銷量占全球果汁的一半以上。其中，中高檔的復(fù)原橙汁和非復(fù)原橙汁(以下統(tǒng)稱100%橙汁)以其天然、健康、純凈的特色備受消費(fèi)者青睞。然而由于國(guó)內(nèi)柑橘主要是鮮食品種，大量100%橙汁的生產(chǎn)原料需從巴西、美國(guó)、以色列等地進(jìn)口。在供應(yīng)短缺的情況下，不法人員受利益驅(qū)使向橙汁中加入廉價(jià)原材料，如甘蔗糖、甜菜糖或高果玉米糖漿，來冒充100%橙汁。雖然國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)果汁含量有明確要求，但由于國(guó)內(nèi)相關(guān)研究起步較晚，當(dāng)前對(duì)橙汁質(zhì)量的檢測(cè)主要集中在理化、農(nóng)殘、微生物和重金屬等方面[1-7]，缺乏有效地鑒別100%橙汁的技術(shù)方法。

國(guó)外有研究表明，穩(wěn)定碳同位素技術(shù)在食品質(zhì)量評(píng)估中具有重要作用[8-16]。在橙汁質(zhì)量鑒別和產(chǎn)地溯源領(lǐng)域，穩(wěn)定同位素的應(yīng)用研究也取得了一些突破性進(jìn)展[17-22]，其中根據(jù)碳同位素組成檢測(cè)橙汁的C4植物糖的方法已被采納為國(guó)際方法。然而，目前國(guó)際上通用的測(cè)定果汁中總糖和果肉δ13C的方法[23]存在勞動(dòng)強(qiáng)度大、對(duì)實(shí)驗(yàn)人員要求高的特點(diǎn)，難以推廣實(shí)施。

本研究擬建立元素分析-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜(EA-IRMS)測(cè)定橙汁中總糖和果肉δ13C的方法。通過調(diào)查天然橙汁中碳同位素特征，并對(duì)摻入C4和C3 植物糖漿的橙汁檢測(cè)進(jìn)行研究，希望為我國(guó)有關(guān)部門進(jìn)一步開展橙汁摻假鑒別研究及監(jiān)管工作提供科學(xué)根據(jù)和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要裝置與儀器

元素分析-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀：美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品；Flash 2000 EA，Delta V Advantage IRMS，離心機(jī)：美國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品；冷凍干燥機(jī)：北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫水浴箱：北京中慧天誠(chéng)科技有限公司產(chǎn)品；磁力攪拌器：北京世紀(jì)華科實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；十萬分之一天平：瑞士Mettler-Toledo公司產(chǎn)品。

1.2 主要試劑與材料

丙酮、氫氧化鈣和硫酸(分析純)：北京化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；錫杯：Element Microanalysis公司產(chǎn)品；EA-IRMS標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：IAEA 600(δ13CPDB=-27.771±0.043‰)和IAEA-CH-6(δ13CPDB=-10.40 ± 0.2‰)，由國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)提供。

6種臍橙樣品：產(chǎn)地分別為中國(guó)、菲律賓和美國(guó)；甜菜糖和甘蔗糖：均購(gòu)自家樂福超市。

1.3 樣品處理

樣品處理過程參照文獻(xiàn)[23]進(jìn)行。選取新鮮、飽滿、無病斑、無劃痕的臍橙，去除果皮和果核后榨汁，經(jīng)3層紗布過濾后，取濾液待用。

1.3.1分離橙汁中總糖和果肉 取40 mL橙汁于50 mL離心管中，在相對(duì)離心力(RCF)為1 400 g 條件下離心10 min，將上清液和沉淀分別保存待用。

1.3.2純化分離總糖 將1.3.1中得到的上清液轉(zhuǎn)移至100 mL小燒杯中，加入1.6 g氫氧化鈣粉末，攪拌均勻后于90 ℃水浴中靜置3 min；將上述熱溶液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，在RCF為1 400 g條件下離心3 min，去除沉淀，用0.1 mol/L硫酸溶液調(diào)整上清液至pH 5.0；將酸化后的上清液置于4 ℃冰箱靜置約15 h，去除沉淀，將溶液冷凍干燥，并均質(zhì)成粉末。

1.3.3純化分離果肉 用蒸餾水復(fù)溶1.3.1中的沉淀至40 mL，在RCF為1 400 g條件下離心10 min后，去除上清液，重復(fù)操作1次；取10 mL丙酮復(fù)溶沉淀并離心，去除上清液后，再用丙酮洗滌沉淀2次；去除沉淀中殘留的丙酮，將沉淀進(jìn)行冷凍干燥，并均質(zhì)成粉末。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件

氧化管溫度980 ℃，還原管溫度680 ℃，柱溫60 ℃，氦氣流速100 mL/min。稱取約0.1 mg粉末于錫杯中，包好后待測(cè)；每個(gè)樣品平行測(cè)定2次，得出樣品的δ13C。

樣品測(cè)定序列中同時(shí)測(cè)定2個(gè)參考物質(zhì)，依據(jù)Stephen等[24]報(bào)道的校正法進(jìn)行校正，得出樣品的δ13CPDB。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理步驟的影響

樣品前處理過程涉及多次洗滌、離心，對(duì)于分子質(zhì)量較小的葡萄糖、果糖和蔗糖，若提取時(shí)糖的回收率不能達(dá)到100%，可能導(dǎo)致碳同位素出現(xiàn)動(dòng)力學(xué)分餾。為驗(yàn)證前處理過程中的碳同位素分餾現(xiàn)象，以葡萄糖為研究對(duì)象(EA-IRMS測(cè)得其δ13CPDB=-10.92±0.08‰，n=5)，配制100 g/L葡萄糖水溶液，按照1.3中步驟進(jìn)行處理后，測(cè)定其δ13CPDB，結(jié)果列于表1。其中標(biāo)準(zhǔn)偏差最大為0.18‰，結(jié)果表明，該樣品處理過程分離純化橙汁總糖時(shí)不會(huì)導(dǎo)致碳同位素分餾。

表1 葡萄糖δ13CPDB分餾實(shí)驗(yàn)Table 1 Carbon isotope fractionation test

注： *表示3次測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

**表示2份糖的測(cè)定偏差

2.2 穩(wěn)定性分析

以一種橙汁為研究對(duì)象，分離、干燥并測(cè)定其總糖和果肉的δ13CPDB值，重復(fù)測(cè)定4次，結(jié)果列于表2。其中最大的標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為0.1‰，說明使用該方法測(cè)定橙汁中總糖和果肉的δ13CPDB符合重復(fù)性測(cè)定要求。

表2 橙汁中總糖和果肉的δ13CPDB測(cè)定重復(fù)性Table 2 Repeatabilities of δ13CPDB of sugar and pulp from orange juice

2.3 果肉中殘?zhí)球?yàn)證

為驗(yàn)證該方法能夠得到完全不含糖分的果肉樣品，即驗(yàn)證果肉粉末中是否會(huì)有糖分殘留，需選擇一種橙汁為研究對(duì)象，分別加入50 g/L、100 g/L葡萄糖(δ13CPDB=-10.92)水溶液，制備為樣品1和樣品2，然后按照1.3中的方法進(jìn)行前處理，并測(cè)定果肉的δ13CPDB值，結(jié)果列于表3。

表3 不同摻糖果汁中果肉的δ13CPDBTable 3 δ13CPDB of pulp from fake orange juices

由表3中數(shù)據(jù)可知，加入不同濃度的葡萄糖溶液，盡管葡萄糖的δ13CPDB與目標(biāo)橙汁相差懸殊，但結(jié)果表明，該處理方式下得到的果肉粉末中并無糖殘留，說明前處理方法能夠有效地分離果肉和總糖。

2.4 方法再現(xiàn)性

為驗(yàn)證方法的再現(xiàn)性，本研究按照GB 6379.2 《測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度(正確度與精密度)第2部分：確定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量方法重復(fù)性與再現(xiàn)性的基本方法》的有關(guān)規(guī)定對(duì)本方法進(jìn)行了對(duì)比分析，各實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的平均結(jié)果列于表4。結(jié)果表明，該方法的重現(xiàn)性整體優(yōu)于CEN標(biāo)準(zhǔn)中認(rèn)定的重現(xiàn)性要求。

2.5 橙汁中δ13CPDB的特征

將不同產(chǎn)地的臍橙榨汁后測(cè)定其總糖和果肉的δ13CPDB值，結(jié)果示于圖1。

初步研究表明，產(chǎn)自中國(guó)、菲律賓和美國(guó)的臍橙中總糖與果肉的δ13CPDB均顯現(xiàn)出C3植物的碳同位素特征，波動(dòng)范圍為-25.40‰～-27.21‰，并且糖和果肉的δ13CPDB顯示出良好的相關(guān)性，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.996。

2.6 橙汁中δ13CPDB與外源糖含量的關(guān)系

為確定橙汁總糖和果肉δ13CPDB與外源糖含量的關(guān)系，以某產(chǎn)地橙汁為研究對(duì)象，按5%、10%、15%、30%和40%的比例向橙汁中加入同等濃度的甘蔗糖水溶液(δ13CPDB=-12.38‰)，處理后測(cè)定上述模擬“橙汁”的總糖和果肉的δ13CPDB值，結(jié)果示于圖2。

表4 橙汁中總糖和果肉δ13CPDB的實(shí)驗(yàn)室協(xié)同實(shí)驗(yàn)測(cè)定值Table 4 Repeatability and reproducibility of δ13CPDB of sugar and pulp from orange juice

圖1 橙汁中總糖與果肉δ13CPDB的關(guān)系Fig.1 Correlation between the δ13CPDB of sugar and pulp recovered from orange juice

圖2 δ13CPDB與甘蔗糖含量的相關(guān)性分析Fig.2 Plot of δ13CPDB values of sugars and pulp, versus percentage of cane sugar addition

由圖2可見，由于甘蔗糖來源于C4植物甘蔗，其δ13CPDB與橙汁總糖和果肉差異顯著，上述樣品中總糖的δ13CPDB隨甘蔗糖溶液含量的增大而上升，且δ13CPDB與甘蔗糖溶液比例呈顯著正相關(guān)。然而，無論甘蔗糖溶液含量多少，樣品果肉中δ13CPDB始終恒定，利用此關(guān)系，可以以橙汁樣品的果肉為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算樣品中甘蔗糖含量，橙汁中甘蔗糖含量的計(jì)算公式為：

式中，W為產(chǎn)品中甘蔗糖含量；δ13C果肉為產(chǎn)品的果肉中δ13CPDB值；δ13C糖為產(chǎn)品的糖中δ13CPDB測(cè)定值。根據(jù)表3，自然狀態(tài)下糖中δ13CPDB比果肉偏正最大值為0.13‰；本研究中甘蔗糖的δ13CPDB值為-12.38。

然而向橙汁中摻入同等濃度的甜菜糖溶液時(shí)，由于甜菜與臍橙同屬C3植物，盡管摻入量接近40%，但糖中δ13CPDB依然在本實(shí)驗(yàn)所得到的橙汁δ13CPDB的波動(dòng)范圍內(nèi)，結(jié)果列于表5。這表明本方法難以檢出橙汁中混入的其他C3植物糖。

表5 摻入甜菜糖后橙汁糖中δ13CPDBTable 5 δ13CPDB of sugar from faked samples

3 討論

植物因光合作用途徑差異而被分為C3植物、C4植物和CAM植物，相應(yīng)的有機(jī)質(zhì)穩(wěn)定碳同位素組成也呈現(xiàn)明顯差異，這是穩(wěn)定碳同位素分析技術(shù)用于鑒別100%果汁真實(shí)性的基礎(chǔ)。需要說明的是，盡管有機(jī)質(zhì)中碳同位素組成主要受光合作用途徑影響，但氣候條件、生長(zhǎng)環(huán)境、水分脅迫作用，肥料中C/N比均會(huì)導(dǎo)致同種植物有機(jī)質(zhì)的碳同位素組成差異，本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)；同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)所建立的鑒別C4植物糖的技術(shù)只是以單一的干蔗糖為例，未研究其他C4植物，如玉米等的碳同位素組成，亦未深入調(diào)查不同地區(qū)同一種C4植物的碳同位素組成差異，尤為重要的是在建立鑒別公式時(shí)所依據(jù)的橙汁樣本也僅有6個(gè)，這在應(yīng)用穩(wěn)定同位素技術(shù)進(jìn)行鑒別時(shí)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，因此，本實(shí)驗(yàn)只是以少量的數(shù)據(jù)揭示橙汁自有的碳同位素特征，簡(jiǎn)單介紹本技術(shù)對(duì)100%橙汁真實(shí)性鑒別中的應(yīng)用潛力，而真正的推廣應(yīng)用還需建立在系統(tǒng)的回歸關(guān)系分析和詳盡的鑒別精度研究的基礎(chǔ)之上。

4 結(jié)論

本研究建立了離心干燥法結(jié)合EA-IRMS測(cè)定橙汁中總糖和果肉δ13CPDB的方法，該方法的前處理過程中無同位素分餾產(chǎn)生，能夠完全分離總糖和果肉，重復(fù)性良好，再現(xiàn)性結(jié)果也符合CEN的要求。 針對(duì)不同橙汁中總糖和果肉的實(shí)驗(yàn)研究表明：同一來源的兩種物質(zhì)的δ13CPDB呈良好相關(guān)性，而模擬實(shí)驗(yàn)表明總糖δ13CPDB與外加的甘蔗糖含量顯著相關(guān)，但果肉δ13CPDB保持恒定，因此該技術(shù)可用于橙汁樣品中C4植物糖含量檢測(cè)。

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