張愛(ài)紅，林虹君，黃順祥，周學(xué)志

(1. 中國(guó)人民解放軍防化學(xué)院，北京 102205；2. 空軍防化大隊(duì)，北京 102206)

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷深入，其研究方向由定性表達(dá)譜向定量研究發(fā)展，而新的定量方法的研究是生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)、驗(yàn)證和確認(rèn)的重要支撐。蛋白質(zhì)組學(xué)定量方法包括基于標(biāo)記和非標(biāo)記結(jié)合生物質(zhì)譜的方法，而基于非標(biāo)記的質(zhì)譜是半定量方法，限制了其在定量研究中的應(yīng)用，因此研究工作仍然側(cè)重于基于標(biāo)記的質(zhì)譜定量方法。蛋白質(zhì)標(biāo)記方法主要有化學(xué)標(biāo)記和生物標(biāo)記?；瘜W(xué)標(biāo)記包括：乙?；瘶?biāo)記、同位素標(biāo)記[1]和ITRAQ標(biāo)記[2-3]等；生物標(biāo)記包括：SILAC標(biāo)記[4]等。另外，酶促標(biāo)記(如18O[5]標(biāo)記)也是常用的標(biāo)記方法，但其穩(wěn)定性和標(biāo)記的完全性還存在問(wèn)題，因此尋求其它標(biāo)記方法仍是定量研究的重要內(nèi)容。

Meares研究組[6]在2004年以化學(xué)性質(zhì)很相近的稀土金屬元素為質(zhì)量標(biāo)簽，提出了針對(duì)蛋白質(zhì)巰基標(biāo)記的新方法“元素標(biāo)記親和標(biāo)簽”(element-coded affinity tags, ECAT)。Liu等[7]在2006年將稀土金屬通過(guò)雙功能試劑與標(biāo)準(zhǔn)肽段結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)相對(duì)定量?？捎糜跇?biāo)記的金屬很多，而且很多蛋白質(zhì)本身就含有金屬，如鐵、鋁等。由于有些金屬在檢測(cè)本底中容易產(chǎn)生干擾，且不易與蛋白質(zhì)自身所帶的金屬區(qū)分開(kāi)[8-15]，所以，在作為標(biāo)簽使用時(shí)，一般采用稀土金屬元素。稀土金屬元素用于蛋白質(zhì)標(biāo)記具有以下優(yōu)點(diǎn)：各金屬元素的物理化學(xué)性質(zhì)非常相近，可以組成多種組合；與同位素試劑相比，稀土金屬價(jià)格便宜[16]；稀土金屬元素之間的分子質(zhì)量相差較大，可以有效避免同位素質(zhì)譜峰重疊；與無(wú)機(jī)質(zhì)譜結(jié)合對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析，具有檢測(cè)靈敏度高、定量動(dòng)態(tài)范圍大等特點(diǎn)[17]。該方法的缺點(diǎn)是標(biāo)記效率低，對(duì)于2種以上不同金屬標(biāo)記的可能性尚未研究。

本研究選用稀土金屬鋱(Tb)、釔(Y)[18]、銩(Tm)、鈥(Ho)和镥(Lu)[19]作為質(zhì)量標(biāo)簽，首先對(duì)標(biāo)記條件進(jìn)行優(yōu)化，然后分別對(duì)標(biāo)記效率、色譜行為、穩(wěn)定性以及離子交換等指標(biāo)進(jìn)行考察。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

4800 MALDI TOF/TOF Analyzer基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國(guó)AB Sciex公司產(chǎn)品；SC100A Speedvac Plus MODULYOD-230真空離心干燥機(jī)：美國(guó)Thermo Savant公司產(chǎn)品；P230高效液相色譜儀：大連依利特分析儀器有限公司產(chǎn)品；Milli-Q純水系統(tǒng)：美國(guó)Merck Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

二乙三胺五乙酸雙酸酐(diethylenetriamine-N,N,N',N'',N'''-pentaacetic acid dianhydride，DTPA雙酸酐)，四氮雜環(huán)十二烷四乙酸(DOTA)：日本Dojindo公司產(chǎn)品；三乙二胺碳酸鹽(Triethylammonium bicarbonate, TEAB)：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；乙腈(HPLC級(jí))：美國(guó)J.T.Baker公司產(chǎn)品；乙酸、醋酸銨(分析純)：北京化工廠產(chǎn)品；TbCl3、YCl3、TmCl3、HoCl3、LuCl3(分析純)：由中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院提供。

1.3 樣品溶液

TEAB：物質(zhì)的量濃度0.05 mol/L，pH 7.0；醋酸銨：物質(zhì)的量濃度0.1 mol/L，pH 6.0。

1.4 質(zhì)譜分析條件

對(duì)樣品分析時(shí)，取5 μL處理好的樣本溶液與飽和基質(zhì)溶液(將5 g/Lα-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)溶于含0.1% 三氟乙酸(TFA)的50%乙腈中)，按照體積比1∶9混合，取0.6 μL點(diǎn)靶，空氣中揮發(fā)干燥，用基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

數(shù)據(jù)采集條件：正離子反射模式；加速電壓20 kV；質(zhì)量掃描范圍m/z700～1 600；4 000 series譜圖采集軟件，累計(jì)采集1 500～2 000次。

根據(jù)同一肽段與金屬元素標(biāo)記后和標(biāo)記前質(zhì)譜峰峰高的比值來(lái)評(píng)估反應(yīng)進(jìn)行的程度，從而確定標(biāo)記反應(yīng)的最佳條件。用標(biāo)準(zhǔn)多肽混合物進(jìn)行質(zhì)譜儀的外標(biāo)校正。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)記元素的選擇

選擇金屬元素時(shí)，首先考慮單同位素金屬作為標(biāo)記元素，目的是降低樣品質(zhì)譜圖的復(fù)雜程度，便于分子質(zhì)量相差較小的質(zhì)譜峰之間的比較，提高解圖的準(zhǔn)確率。稀土金屬元素中有8種是單同位素，列于表1。按照兩兩配對(duì)，能夠形成28種組合，質(zhì)量差從1～86 u不等，按照差值不小于4 u的原則，共有25種有效組合。其次考慮金屬元素的螯合常數(shù)要足夠大。將金屬元素和肽段連接起來(lái)的雙功能試劑DTPA雙酸酐與各金屬的螯合常數(shù)列于表2，如此大的螯合常數(shù)可以確保金屬質(zhì)量標(biāo)簽的穩(wěn)定性。再次，不同金屬元素的螯合常數(shù)相差不宜過(guò)大。差值過(guò)大則意味著兩者在同一體系時(shí)，容易發(fā)生金屬離子的交換，因此所選元素的螯合常數(shù)相差以不超過(guò)1為宜。據(jù)此條件，選擇89Y、159Tb、165Ho、169Tm、175Lu作為研究對(duì)象，對(duì)質(zhì)量標(biāo)簽的穩(wěn)定性、色譜和質(zhì)譜等行為進(jìn)行考察[20]。

表1 稀土元素中的單同位素元素

表2 8種單同位素元素與DTPA雙酸酐的螯合常數(shù)

2.2 標(biāo)記條件優(yōu)化

稀土金屬標(biāo)記方法是經(jīng)由雙功能試劑將稀土金屬元素與目標(biāo)肽段連接起來(lái)，通過(guò)對(duì)該質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)記肽段定量測(cè)定達(dá)到對(duì)蛋白質(zhì)定量檢測(cè)的目的。由于雙酸酐在水溶液中極易水解，所以標(biāo)記時(shí)要嚴(yán)格遵循一定的反應(yīng)順序，且迅速完成。首先選用標(biāo)準(zhǔn)肽段Kemptide進(jìn)行標(biāo)記條件優(yōu)化，具體步驟為：將0.14 mg標(biāo)準(zhǔn)肽段Kemptide和3.26 mg DTPA雙酸酐固體加入到320 μL TEAB溶液中，劇烈渦振1 min，離心樣品至管底，室溫放置0.5 h，真空離心干燥；然后用醋酸銨緩沖液重新溶解凍干的樣品，再加入金屬元素，于37 ℃水浴2 h，為了提高金屬元素的標(biāo)記效率，加入金屬離子的物質(zhì)的量為DTPA雙酸酐的5倍，將反應(yīng)產(chǎn)物按體積比1∶9與基質(zhì)混合，取0.6 μL點(diǎn)靶，進(jìn)行MALDI-TOF MS分析。在肽段與DTPA雙酸酐結(jié)合后的譜圖中未出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)肽段LRRASLG的質(zhì)譜峰(m/z771.910 6)，而出現(xiàn)較強(qiáng)的肽段與DTPA雙酸酐結(jié)合后的質(zhì)譜峰(m/z1 147.455 8)，表明肽段與DTPA雙酸酐結(jié)合效率達(dá)到了100%，示于圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)肽段(LRRASLG)與DTPA雙酸酐結(jié)合的質(zhì)譜圖Fig.1 The MS spectra of standard peptide (LRRASLG) combined with DTPA dianhydride

在此基礎(chǔ)上，考察了雙酸酐試劑與金屬元素的標(biāo)記效率。由于雙酸酐試劑與金屬元素的絡(luò)和效率不僅與螯合常數(shù)有關(guān)，還與體系溫度、反應(yīng)時(shí)間、緩沖液pH和金屬過(guò)量倍數(shù)有關(guān)，因此，為了得到最佳的螯合率，選擇金屬銩和鈥對(duì)以上影響因素進(jìn)行考察。通過(guò)對(duì)反應(yīng)溫度分別為25、37、60、80 ℃的情況進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)在37 ℃時(shí)的標(biāo)記效率最高，達(dá)到71%，示于圖2a；通過(guò)對(duì)pH 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的情況進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)在pH 6時(shí)的螯合率最高，達(dá)到76%，示于圖2b；通過(guò)對(duì)反應(yīng)時(shí)間0.5、1、2、3、5 h和過(guò)

夜的情況進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)2 h時(shí)的螯合率最高，達(dá)到86%，示于圖2c；通過(guò)對(duì)金屬離子與DTPA雙酸酐的物質(zhì)的量比例為1倍、2倍、3倍、5倍、10倍的情況進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)在兩者比例為5倍時(shí)的螯合率最高，達(dá)到90%，示于圖2d。

從圖2可以看出，優(yōu)化后的最佳條件為：溫度37 ℃、pH 6、反應(yīng)時(shí)間2 h、金屬離子濃度是肽段的5倍，此條件也同樣適用于其它稀土金屬元素。在此條件下得到的Y、Tb、Ho、Tm和Lu質(zhì)譜圖示于圖3，其標(biāo)記率列于表3。

圖3表明，不同金屬元素與同一肽段的結(jié)合率不同，其中Y和Tb的標(biāo)記率較為相近，Ho和Tm的標(biāo)記率較為相近，具體數(shù)據(jù)列于表3。接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)，將Y和Tb，Ho和Tm分別作為一組用于雙金屬標(biāo)簽標(biāo)記，只有Lu標(biāo)記率較低，且雜峰較多，不宜與其它元素配對(duì)，因此，將主要對(duì)Y、Tb、Ho和Tm四種元素進(jìn)行研究。

圖2 反應(yīng)溫度(a)、pH值(b)、反應(yīng)時(shí)間(c)和金屬離子與DTPA雙酸酐物質(zhì)的量之比(d)對(duì)螯合效率的影響Fig.2 The effect of temperature (a), pH (b), time (c) and mole ratio of metal ion to DTPA dianhydride (d) on chelation rate

圖3 標(biāo)準(zhǔn)肽段(LRRASLG)與稀土金屬Y(a)、Tb(b)、Ho(c)、Tm(d)和Lu(e)標(biāo)記的質(zhì)譜圖Fig.3 The MS spectra of standard peptide (LRRASLG) chelated with rare earth metal Y(a)，Tb(b)，Ho(c)，Tm(d) and Lu(e)

金屬元素名稱LRRASLG-DTPA (m/z, 1+)LRRASLG-DTPA-M (m/z, 1+)標(biāo)記率/%標(biāo)準(zhǔn)偏差/%Y1 147.745 21 233.637 575.66.7Tb1 147.433 11 303.306 572.85.6Ho1 147.641 51 309.547 289.94.9Tm1 147.561 81 313.557 092.57.3Lu1 147.543 11 319.445 768.96.8

各金屬元素的標(biāo)記反應(yīng)式相同，以金屬Y為例，標(biāo)記反應(yīng)式如下：

LRRASLG-DTPA+Y=LRRASLG-DTPA-Y

2.3 金屬標(biāo)記物的穩(wěn)定性考察

金屬標(biāo)簽的穩(wěn)定性對(duì)其在實(shí)際樣品中的應(yīng)用至關(guān)重要，因此該質(zhì)量標(biāo)簽要具備一定的穩(wěn)定性。Tb和Y的穩(wěn)定性已在Liu等[7]研究中考察，下面僅對(duì)Tm和Ho進(jìn)行研究。將標(biāo)記好的樣品于4 ℃放置1周后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，仍有95%(峰強(qiáng)度)的標(biāo)記產(chǎn)物被檢測(cè)到。放置2周、3周、4周后再分別檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)質(zhì)譜峰強(qiáng)度逐漸下降，金屬離子標(biāo)記的目標(biāo)峰比例逐漸下降，肽段的質(zhì)譜峰和第一步反應(yīng)產(chǎn)物的質(zhì)譜峰逐漸增強(qiáng)。Tm和Ho在4 ℃放置的質(zhì)譜圖示于圖4。

從圖4可以看出，將標(biāo)記有金屬的質(zhì)量標(biāo)簽在4 ℃放置一段時(shí)間后，由于溫度的降低，質(zhì)量標(biāo)簽會(huì)有部分降解，且隨著放置時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，尤其是超過(guò)2周，質(zhì)量標(biāo)簽的分解逐漸增強(qiáng)，標(biāo)簽的峰強(qiáng)度逐漸降低，生成中間產(chǎn)物的峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。因此，若將標(biāo)記好的標(biāo)簽用于定量研究，則放置時(shí)間不宜超過(guò)2周。

2.4 金屬交換現(xiàn)象的考察

當(dāng)質(zhì)量標(biāo)簽含有兩種或更多不同金屬元素的標(biāo)簽時(shí)，除考慮各個(gè)絡(luò)合物的穩(wěn)定性外，還要考慮各金屬元素之間的交換標(biāo)記問(wèn)題。由于不同金屬元素與DTPA雙酸酐的結(jié)合常數(shù)不完全相同，當(dāng)該常數(shù)相差較大的兩種金屬絡(luò)合物在同一體系時(shí)，螯合常數(shù)大的金屬離子可能將螯合常數(shù)小的金屬離子從其絡(luò)合物中置換出來(lái)，影響標(biāo)記。

為此，分別將金屬鈥的鹽酸鹽加入到標(biāo)記好的銩-肽溶液中，將金屬銩的鹽酸鹽加入到鈥-肽溶液中，兩者均放置24 h，Ho和Tm的交換結(jié)果表明，只有很少(小于3%)的金屬發(fā)生了置換(標(biāo)簽m/z1 309.132 6置換m/z1 313.133 1，標(biāo)簽m/z1 313.132 7置換m/z1 309.131 1)。同樣，將金屬Y的鹽酸鹽加入到標(biāo)記好的Tb-肽溶液中，將金屬Tb的鹽酸鹽加入到Y(jié)-肽溶液中，置換24 h，Tb和Y的交換結(jié)果表明，只有很少(小于3%)的金屬發(fā)生了置換(標(biāo)簽m/z1 233.432 6置換m/z1 303.417 5，標(biāo)簽m/z1 303.483 5置換m/z1 233.467 0)。金屬交換實(shí)驗(yàn)的質(zhì)譜圖示于圖5。

置換反應(yīng)式如下：

LRRASLG-DTPA-Tm+Ho=

LRRASLG-DTPA-Ho+Tm

LRRASLG-DTPA-Ho+Tm=

LRRASLG-DTPA-Tm+Ho

LRRASLG-DTPA-Tb+Y=LRRASLG-DTPA-Y+Tb

LRRASLG-DTPA-Y+Tb=LRRASLG-DTPA-Tb+Y

以上結(jié)果表明，結(jié)合常數(shù)是選擇金屬元素的一個(gè)重要指標(biāo)，既要保證該常數(shù)足夠大(有足夠穩(wěn)定性)，又要保證金屬元素相互之間相差不能太大(避免交換標(biāo)記)。

2.5 金屬標(biāo)記物的色譜行為考察

Liu等[7]已對(duì)Y和Tb的共洗脫進(jìn)行過(guò)考察，發(fā)現(xiàn)兩種金屬對(duì)同一肽段標(biāo)記的質(zhì)量標(biāo)簽是共洗脫。本研究考察了金屬Tb、Ho、Tm、Lu與肌紅蛋白(myoglobin, MYO)酶切肽段的洗脫行為，首先對(duì)肌紅蛋白酶切肽段進(jìn)行標(biāo)記，然后將標(biāo)記有不同稀土金屬的肽段1、2、3、4經(jīng)LC/MS分析，質(zhì)譜圖示于圖6。

圖6表明，標(biāo)記有金屬Tb、Ho、Tm和Lu的同一肽段為共洗脫，除Lu的洗脫時(shí)間為22.14 min外，其余均為21.90 min，這再次說(shuō)明，稀土元素Lu不適合與其他元素配對(duì)用于標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，基于稀土元素標(biāo)記可以用于蛋白質(zhì)組的定量分析，將標(biāo)記有不同稀土金屬離子的肽段混合物通過(guò)LC/MS分析鑒定，標(biāo)記有不同稀土金屬離子的同一肽段在液相分離中能夠被共洗脫。

圖4 稀土金屬銩(Tm)標(biāo)記產(chǎn)物放置1周(a)、2周(b)、3周(c)、4周(d)和鈥(Ho)標(biāo)記產(chǎn)物放置1周(e)、2周(f)、3周(g)和4周(h)的質(zhì)譜圖Fig.4 The MS spectra of thulium (Tm) labeled after one week (a), two weeks (b), three weeks (c), four weeks (d) and holmium (Ho) labeled after one week (e), two weeks (f), three weeks (g) and four weeks (h)

注：a.將鈥元素加入到銩標(biāo)簽；b.將銩元素加入到鈥標(biāo)簽；c.將釔元素加入到鋱標(biāo)簽；d.將鋱?jiān)丶尤氲结悩?biāo)簽圖5 稀土金屬鈥和銩、釔和鋱交換實(shí)驗(yàn)質(zhì)譜圖Fig.5 The MS spectra of rare earth metal holmium and thulium, terbium and yttrium after cross labeled

注：a. Tb; b. Ho; c. Tm; d. Lu圖6 不同金屬離子標(biāo)記的肌紅蛋白酶切肽段LC/MS的共洗脫質(zhì)譜圖Fig.6 The analysis of the labeled peptide mixture of MYO by LC/MS

2.6 檢測(cè)限

為了考察稀土元素標(biāo)記后肽段的檢測(cè)限，本實(shí)驗(yàn)將Tm和Ho標(biāo)記樣品分別稀釋為不同的濃度梯度，列于表4，然后進(jìn)行MALDI源質(zhì)譜分析，結(jié)果示于圖7和圖8。

將Tm和Ho兩元素質(zhì)量標(biāo)簽的濃度分別從432 μmol/L和398 μmol/L稀釋到1.08 μmol/L和1.00 μmol/L，從對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖可以看出，在稀釋不同倍數(shù)后，質(zhì)譜峰強(qiáng)度逐漸減弱，當(dāng)濃度分別達(dá)到1.08 μmol/L和1.00 μmol/L時(shí)，目標(biāo)峰變得很弱，而此時(shí)噪音峰強(qiáng)度已明顯增強(qiáng)。因此，可以得出MALDI源質(zhì)譜對(duì)稀土金屬標(biāo)簽的檢測(cè)限可達(dá)近1 μmol/L。

表4 銩和鈥稀釋后的濃度梯度

2.7 動(dòng)態(tài)范圍

不同金屬元素與肽段標(biāo)記后在質(zhì)譜中的響應(yīng)程度不同，同時(shí)該響應(yīng)程度隨樣品濃度的變化而變化。而且，當(dāng)兩種不同金屬標(biāo)記的樣本在同一體系中時(shí)，相互之間會(huì)有離子抑制效應(yīng)。諸多因素共同作用，使得多元素標(biāo)記時(shí)，理論比例與實(shí)測(cè)比例有較大差別。為了考察稀土金屬的離子抑制效應(yīng)，將兩種元素分別標(biāo)記的肌紅蛋白的酶切肽段溶液按不同比例(物質(zhì)的量之比)混合，進(jìn)行質(zhì)譜分析。

Liu等[7]已對(duì)稀土金屬元素Tb和Y的動(dòng)態(tài)范圍進(jìn)行研究，因此本研究?jī)H對(duì)Ho和Tm進(jìn)行考察。首先將Ho和Tm與MYO酶切肽段進(jìn)行標(biāo)記，然后將標(biāo)記好的肽段分別按比例(Tb/Y)1∶10、1∶6、1∶3、1∶1、3∶1、6∶1、10∶1(物質(zhì)的量之比)混合，進(jìn)行MALDI-TOF MS分析，測(cè)定兩金屬標(biāo)簽的實(shí)際比例，實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表5。

結(jié)果表明，隨著兩金屬濃度差的變化，兩對(duì)金屬的實(shí)測(cè)比例與理論加入比例差異會(huì)增大，而且兩者比例相差越大，由此帶來(lái)的差異也越大。由于一般在定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，當(dāng)差異比值大于2時(shí)，即認(rèn)為是顯著差異，所以，該結(jié)論并不影響差異較大的蛋白質(zhì)組的比較分析。

注：a. 432 μmol/L; b. 43.2 μmol/L; c. 21.6 μmol/L; d. 4.32 μmol/L; e. 2.16 μmol/L; f. 1.08 μmol/L 圖7 不同濃度時(shí)稀土金屬銩(Tm)標(biāo)記產(chǎn)物的質(zhì)譜圖Fig.7 The MS spectra of rare earth metal thulium(Tm) labeled at different concentration

注：a. 398 μmol/L; b. 39.8 μmol/L; c. 19.9 μmol/L; d. 3.98 μmol/L; e. 1.99 μmol/L; f. 1.00 μmol/L圖8 不同濃度時(shí)稀土金屬鈥(Ho)標(biāo)記產(chǎn)物的質(zhì)譜圖Fig.8 The MS spectra of rare earth metal holmium(Ho) labeled at different concentration

測(cè)得比例理論比例1∶101∶61∶31∶13∶16∶110∶1Tb/Y0.200.390.501.654.558.1819.46 Ho/Tm0.130.220.411.163.466.7913.68

2.8 ε-氨基封閉

金屬元素與標(biāo)準(zhǔn)肽段LRRASLG標(biāo)記，不存在側(cè)鏈氨基的干擾問(wèn)題，但對(duì)于蛋白質(zhì)酶切肽段，因含有ε-氨基，而DTPA雙酸酐易與ε-氨基反應(yīng)，又由于位阻等因素的影響，該反應(yīng)進(jìn)行不完全，因此會(huì)使定量結(jié)果誤差顯著增大。所以，在進(jìn)行金屬離子螯合之前，必須將ε-氨基進(jìn)行封閉[21]。 胍基化反應(yīng)封閉賴氨酸的ε-氨基有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)：一是反應(yīng)完全；二是由于高精氨酸的胍基(pKa=12.48)比賴氨酸的氨基(pKa=10.48)有更強(qiáng)的堿性，所以更容易結(jié)合質(zhì)子帶上正電荷，能提高以K結(jié)尾肽段在MALDI源質(zhì)譜分析中的信號(hào)強(qiáng)度。因此，選擇胍基化反應(yīng)封閉賴氨酸的ε-氨基。其反應(yīng)條件為：pH 11.0，胍基化試劑濃度100 mmol/L，反應(yīng)溫度37 ℃，反應(yīng)時(shí)間4 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖9。

由圖9可知，在此條件下，含有賴氨酸的肽段完全被封閉。另外，馬心肌紅蛋白酶切肽段在胍基化修飾前，只有m/z1 606.769 4和m/z1 884.913 6豐度較強(qiáng)；而胍基化修飾后，高豐度峰個(gè)數(shù)和峰整體強(qiáng)度都有明顯提高；因不含ε-氨基，沒(méi)有胍基化修飾的m/z1 606.769 4峰強(qiáng)度沒(méi)有發(fā)生明顯變化。

另外，還選擇α-乳白蛋白和β-乳白蛋白酶切肽段進(jìn)行胍基化修飾，結(jié)果列于表6。

從表6可知，除肽段YDNSLK、YIPGTK和GAAQNIIPASTGAAK胍基化率相對(duì)較低外(仍大于95%)，其余肽段的胍基化效率均達(dá)到100%。因此，胍基化反應(yīng)封閉肽段中賴氨酸的ε-氨基方法，可用于稀土元素標(biāo)記前樣本處理。

圖9 馬心肌紅蛋白酶切肽段胍基化修飾前(a)和修飾后(b)的質(zhì)譜圖Fig.9 The MS spectra of peptides from MYG before guanidination(a) and after guanidination(b)

α-乳白蛋白β-乳白蛋白肽段序列胍基化前肽段質(zhì)量胍基化后肽段質(zhì)量胍基化率/%肽段序列胍基化前肽段質(zhì)量胍基化后肽段質(zhì)量胍基化率/%VIISAPSADAPMFVMGVNHEK2 213.109 32 255.826 7100.00GITWKEETLMEYLENPK2 081.025 92 123.697 8100.00GAAQNIIPASTGAAK1 369.743 41 411.583 995.33TGQAPGFTYTDANKNK1 712.823 81 796.859 8100.00VIPELNGK869.509 1911.352 7100.00CAQCHTVEKGGK1 018.444 41 060.398 7100.00TVDGPSGK760.383 5802.322 3100.00EDLIAYLKK964.534 91 006.421 7100.00YDNSLK739.362 1781.29596.86MIFAGIK779.448 4821.364 3100.00AAFNSGK694.351 8736.281 6100.00YIPGTK678.382 1720.314 996.58FHGTVK688.377 7730.309 7100.00

3 結(jié)論

本研究通過(guò)選擇稀土金屬Tb、Y、Tm、Ho和Lu對(duì)標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)肽段的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)標(biāo)記效率、色譜行為、標(biāo)記穩(wěn)定性和離子交換等現(xiàn)象進(jìn)行考察。結(jié)果表明：金屬元素標(biāo)記效率較高，而且在4 ℃放置一周后，仍可檢測(cè)到95%；標(biāo)有不同金屬元素的肽段可以在色譜分離時(shí)共洗脫；在結(jié)合常數(shù)相差不大(差值小于1)的情況下，金屬交換標(biāo)記現(xiàn)象可以忽略，不會(huì)對(duì)標(biāo)記產(chǎn)生影響；標(biāo)記有金屬元素的肽段在MALDI源質(zhì)譜中的響應(yīng)度可達(dá)1 μmol/L；在兩種金屬濃度差不超過(guò)6倍時(shí)，由離子抑制帶來(lái)的影響較小，不影響差異較大的蛋白質(zhì)組的比較分析；對(duì)于ε-氨基的干擾問(wèn)題，通過(guò)胍基化修飾可以進(jìn)行有效的封閉。這些為目前金屬標(biāo)記應(yīng)用于蛋白質(zhì)相對(duì)定量提供了新的選擇。另外，該標(biāo)記方法若與電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)結(jié)合，可對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行絕對(duì)定量，ICP-MS[22]具有對(duì)極低含量元素實(shí)施精確定量的優(yōu)勢(shì)(可達(dá)10-15)，這使得該方法在蛋白質(zhì)絕對(duì)定量研究中顯示出巨大的潛力。

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