孫立民

(上海交通大學分析測試中心， 上海 200240)

1 化學成像

二次離子質譜的第2個主要操作模式是成像分析。高度聚焦的一次離子束，一般為液態(tài)金屬源(如Cs、Ga、Au、Bi、In)，按照一定次序“掃描”式的在樣品表面所選擇的區(qū)域里轟擊。與此同時，質譜檢測器檢測并記錄被轟擊點上所產生的二次離子及其強度。單個二次離子在掃描范圍內每個轟擊點上的強度用顏色深淺表達出來，就得到該離子強度分布的二維圖像，也就是二次離子質譜(SIMS)圖像。SIMS圖像可以直接或間接地描述元素或分子的二維化學分布(定性或半定量)。質譜檢測器根據(jù)工作原理的不同，可分為四極桿、磁式和飛行時間等，它們的主要區(qū)別之一是二次離子被檢測的順序不同。 使用四極桿或磁式檢測器， 二次離子需要單個被檢測；而使用飛行時間檢測器， 所有二次離子可同時被檢測。因此，在成像分析中,飛行時間檢測器的優(yōu)勢是從一次常規(guī)檢測過程中就可獲得所有可以檢測到的離子的成像。 SIMS成像技術是質譜技術和表面成像技術的結合。理論上講，質譜圖中所檢測到的每個譜峰的二維強度分布都能夠通過成像技術而獲得，但是，如果要求圖像有一定的空間分辨率，則只有相當強的譜峰才可以產生有較高信噪比的圖像。這主要是由于為了保證空間分辨率，需要減小一次離子束斑大小，從而造成離子束流密度大大降低。在這種條件下，譜圖中強度較小的峰就不能在成像模式下被檢測出來?；跍p小一次離子束斑的原理，ION TOF 公司的TOF-SIMS 儀器設計了Burst Alignment模式來做高空間分辨率的成像檢測。在這種模式下，最佳空間分辨率可以達到小于400 nm，然而卻以損失譜圖質量分辨率的1 u水平為代價[1]，由此可見，單純依靠減小一次離子束斑大小不是最好的解決空間分辨率的手段。近年來，為了解決小束斑離子源帶來的信噪比差的問題，新型金屬團簇離子源，如Aun+, Bin+不斷地被開發(fā)，并應用于TOF-SIMS儀器設計上。實驗證明，金屬團簇離子源的使用大大提高了二次離子產額，尤其是對較高質量數(shù)的有機碎片離子和分子離子的效果更為顯著。

隨著TOF-SIMS儀器設計的不斷改進，SIMS的成像功能被廣泛應用于科學與技術研究中[2]，在生物生命科學領域的研究與開發(fā)更是儀器廠家與科學家們關注的熱點[3]。目前，TOF-SIMS成像技術在生物芯片[4]，藥物輸運載體[5]，細胞[6]，器官組織[7]，植入體內的生物材料[8]，組合化學法多肽固相合成[9]等多種生命生物科學的研究中成功應用。本工作就TOF-SIMS成像技術在生物芯片、細胞、生物體組織3方面的應用研究做簡略的介紹。

1.1 生物芯片

生物分子微陣列芯片的制作通常是經過多步且空間被分辨的表面雜化反應過程完成的。 因此，需要在制備的每個步驟中對反應產物進行空間上可分辨的化學結構鑒定和表征[10]。當空間陣列的尺度在微米～亞微米范圍時，TOF-SIMS化學成像技術的空間分辨率可滿足表征單個及多個陣列點上分子及元素的化學信息要求。TOF-SIMS 成像技術已被應用于制備微米甚至納米尺度的DNA[4，10-12]，蛋白質[13-15]，及多糖微陣列[16-17]的工作中。

Attavar等[10]在制備DNA 鋁基金屬芯片時，使用PO2-和PO3-的疊加圖像來表征被烷基磷酸所鈍化的區(qū)域，同時使用SiCO2H3-離子圖像表征硅烷化處理后硅氧烷分子分布的區(qū)域。這些圖像顯示烷基磷酸分布于Al表面區(qū)域，而硅氧烷分子僅僅分布于正方形窗口處玻璃襯底區(qū)域(200 μm×200 μm)。由此可以看出，TOF-SIMS圖像可以較為便利地完成空間上可分辨的化學結構鑒定。Tuccitto等[11]在使用甲苯三聯(lián)吡啶為標簽制備圖案密度可控的寡核苷酸陣列時，使用TOF-SIMS的正性和負性離子圖像來監(jiān)測ssDNA-ttpy探針的錨定反應，其陳列表面的SIMS圖像示于圖1。由乙二醇基自組裝膜產生的多個特征峰圖像疊加在一起顯示出自組裝膜僅在圖案區(qū)以外分布； ssDNA-ttpy探針產生的特征峰的疊加圖像顯示，ssDNA-ttpy分子僅分布在長方形的圖案區(qū)域內。采用圖像疊加的目的是提高信噪比。Lee 等[12]研究了固定在聚丙烯酰胺型膜的單鏈DNA(ssDNA)微陣列的制備。利用XPS技術的成像、可定量性及小面積分析等功能，表征了陣列(樣點直徑在100～150 μm)的化學組成及目標DNA分子的雜化效率；同時，使用TOF-SIMS離子圖像表征

了DNA和襯底信號的空間分布(空間分辨率為2 μm)。對比未雜化和雜化后陣列樣品的幾個DNA分子產生的二次離子圖像(成像面積為200 μm×200 μm)，包括 PO-，PO2-, PO3-, H2PO4-， 以及4個DNA 堿基的離子峰 (adenine (Ade-H),m/z134； thymine (Thy-H),m/z125； guanine (Gua-H ),m/z150 和 cytosine (Cyt-H)，m/z110)，可以看出 DNA均分布在非接觸式打印樣點區(qū)域內，并且單個樣點內DNA成分的分布均勻。

在一個有化學反應活性的聚合物表面進行微觀蓋印(microstamping)，被稱為MAPS技術。使用這種技術可以將生物配體和蛋白質圖案化到聚合物表面，所制備的陣列的空間分辨率可小于5 μm，且制備方法具有良好的重現(xiàn)性。 MAPS過程需要多步的化學反應處理。在Yang等[13]的工作中，TOF-SIMS的離子圖像除了用于表征生物素(biotin)和鏈霉親和素(streptavidin)被固定在蓋印區(qū)域外，還可以有效地檢驗出每一步反應處理后是否有反應試劑殘留于陣列表面。比如，從二次離子圖像可以發(fā)現(xiàn)，分子質量小的聚二甲基硅氧烷(PDMS)及 Tween 20表面活性劑殘留在陣列表面。能夠檢測陣列上微量殘留試劑是TOF-SIMS成像技術的優(yōu)勢，這要歸功于TOF-SIMS所具有的高檢測靈敏度及優(yōu)秀的化學結構分辨能力， 這也是其他技術(如熒光成像和XPS成像)所遠遠不及的。

當TOF-SIMS用于表征吸附到襯底上的蛋白質分布時，會遇到蛋白質分子離子和蛋白質特征碎片離子產額低的問題，因此，常使用氨基酸離子峰或CN離子峰來表征蛋白質的空間分布。但這些離子峰不具有特異性，即不能直接表明產生它們的蛋白質結構。 另外，CN離子峰的強度通常遠大于其他的碎片峰，因它的圖像有優(yōu)秀的信噪比而常被用來表征蛋白質的空間分布。但是，由于任何含N物質都能產生CN離子峰，因此，CN圖像的使用也會受到干擾。解決這一問題可采用15N同位素標記技術。Belu等[14]在研究鏈霉親和素與圖案化的生物素(點直徑為40 μm，或線寬大約100 μm)的鍵合反應中，使用了15N同位素標記的鏈霉親和素。C15N離子圖像清楚地顯示出經過“培養(yǎng)”反應后，靶鏈霉親和素主要分布在生物素覆蓋的陣列樣點區(qū)域。

碳氫化合物微陣列可用于研究多聚糖與其他生物分子的相互作用。結合TOF-SIMS、XPS、SEM和AFM等多種測試手段，可探討制備工藝對碳氫化合物微陣列質量的影響[16-17]。Scurr等[17]研究了噴涂工藝對微陣列上單個斑點內糖分子，鏈接劑和鹽類分子的化學成分分布均勻性的影響。K+離子圖像代表磷酸鹽緩沖液(PBS)中鹽類分子的分布；S-和HS-加和圖像顯示含硫鏈接劑的分布；C4H7+圖像顯示基底馬來酰亞胺基團的分布；而C2H3O+及C5H7O3+代表糖類分子的分布。在基底效應可忽略的情況下，圖像的顏色強度可以代表二次離子的相對強度，圖像亮度的均勻性可以說明化學成分的均勻性。結果表明，糖分子濃度對噴涂點內化學成分分布的均勻性有較大的影響。

生物芯片陣列新工藝的研究也常借助TOF-SIMS作為有效的檢測手段[18-20]。Sanni等[18]在開發(fā)微透鏡陣列圖案法(microlens array) 制備聚丙烯胺(PAAm)微陣列過程中，使用TOF-SIMS研究在樣品點處(硅氧化物)的PAAm選擇性吸附率以及吸附上的PAAm與4種常見的生物偶聯(lián)分子，包括glutaric anhydride(GA), phenylenediisothiocyanate(PDITC), biotin NHS ester(BNE)和oligonucleotide (DNA)的化學反應。Sanni著重研究了在PAAm溶液中添加離子型和非離子型表面活性劑對PAAm在親水區(qū)域和憎水區(qū)域(烷基單分子層) 吸附的影響。研究中, CN-離子圖像代表PAAm的化學分布; S-和 CSN-離子圖像代表PDITC被固定后的分布; S-和SH-離子圖像代表BNE被固定后的分布; CNO-離子圖像代表GA被固定后的分布;PO3-離子圖像代表DNA被固定后的分布。Bearinger等[19]使用基于光催化作用的平版印刷術(PCL)方法，在聚(丙烯硫醚)嵌段共聚物薄膜(涂在金襯底上)表面制備了線寬為4 μm的“L”形圖案陣列。對比代表共聚合物膜的信號C2H5O+和SO3-與代表金襯底的信號AuO-的TOF-SIMS圖像可以看出，在L形狀圖案區(qū)域處所發(fā)生的光催化反應導致聚合物薄膜的移除和金表面的暴露。Dubey等[21]將活性表面耦合劑N-羥基丁二酰亞胺|(NHS)與“反應惰性”2-甲氧基乙胺(MEO)共同圖案到高分子涂層表面制備出雙組分微陣列。TOF-SIMS成像技術用于檢測反應性及殘留物。m/z98 (C4H4NO2-)和m/z114 (C4H4NO3-)為NHS的5-環(huán)結構的碎片特征峰，m/z58 (C2H2O2-)和m/z43 (C2H3O-)為NHS水解后形成的羧基基團的碎片特征峰，m/z107為光阻材料的特征碎片峰。新鮮制備、水解處理和再生樣品的m/z98 (C4H4NO2-)和m/z114 (C4H4NO3-)離子圖像示于圖2。對比圖像發(fā)現(xiàn)，水解后NHS特征信號消失，而再生樣品重新出現(xiàn)NHS基團。另外，還對反應過程中化學試劑的殘留情況進行了研究。從m/z107離子圖像可以看出，雖然使用溶劑清洗光阻材料，但在陣列表面依然部分殘留。

1.2 脂質細胞膜仿生體系

在應用TOF-SIMS成像技術研究生物分子的實例中，研究對象包括蛋白質、DNA、糖分子和脂質，其中對脂質的研究最多也最成功。從生物學的角度來講，脂質雙分子構成的細胞膜在生命體系中有至關重要的生物功能，然而對于脂質和其他構成細胞膜的生物分子在細胞上/內的相對空間分布還缺乏充分的描述。TOF-SIMS成像技術所具有的亞微米空間分辨率及分子識別能力對這類研究有較好的應用前景。常用的模仿細胞膜內外側結構的單分子層和雙分子層模型體系可以使用LB技術在平整襯底上制備，借助這些模型體系可研究脂質與蛋白質以及脂質與脂質分子間的相互作用。 Zheng 等[22]使用LB技術制備了支撐型三組分膜的模型體系，包含(神經)鞘磷脂 (sphingomyelin，SM)、卵磷脂(phosphatidylcholine，PC)和膽固醇(cholesterol，CH)，并借助TOF-SIMS成像技術研究了膽固醇結構域的形成和卵磷脂和膽固醇之間的相互作用。膽固醇，鞘磷脂以及卵磷脂的分布分別由它們的特征碎片峰m/z369、264、224 的圖像來描繪。由圖像可觀察到膽固醇結構域以及每個組分的相對分布，還能發(fā)現(xiàn)烷基鏈飽和度對膜結構有重要的影響。Baker 等[23]研究了蛋白質與細胞膜單分子層仿生結構的相互作用。該研究采用三組分混合體系，包含二棕櫚酰磷脂酰膽堿 (dipalmitoyl-phosphatidylcholine，DPPC)或二棕櫚酰-磷脂乙醇胺(dipalmitoyl-phosphatidyl ethanolamine， DPPE)、 膽固醇及糖蛋白(glycophorin)。DPPC構成細胞膜外側單分子層仿生結構，而DPPE構成細胞膜內側單分子層仿生結構。3種組分的相對空間分布分別由它們的特征碎片峰DPPC(m/z184)，DPPE(m/z551), CH(m/z369)和glycophorin(m/z59)的圖像來描繪。結果發(fā)現(xiàn)，在DPPC/CH/glycophorin 體系中3組分形成單一相，只有DPPE與膽固醇形成結構域，而糖蛋白構成連續(xù)相。

Gunnarsson等[24]研究了TOF-SIMS一次離子源對表征脂質結構的影響。發(fā)現(xiàn)采用Bi3+一次離子源(80 KeV)對于支撐型脂質雙分子層中尖銳邊緣的TOF-SIMS圖像極限空間分辨率可達60 nm；圖像可以分辨間距小于1 μm、直徑為300 nm的單個囊泡,并可以做選區(qū)(region of

interest, ROI)的譜圖分析。空間分辨率一般受表征離子的檢測效率和一次離子源束斑大小的限制。Bi3+相比于C60+有更高的二次離子產額，能使用更小的離子束斑，因此，Bi3+所產生的高空間分辨率的二次離子圖像更適合于脂質結構的表征。

1.3 單個細胞

TOF-SIMS成像技術在對細胞膜表面和細胞內的生物分子成分分布方面也有應用報道，其中研究較多的是脂質分子的分布。在對單個細胞進行表征時，為了維持其在超高真空腔體內細胞結構的穩(wěn)定性，常常采用低溫條件下的檢測方法。這要求樣品臺在檢測過程中維持低溫，同時需要使用冷凍斷裂法制備樣品。Heien等[25]詳細描述了細胞膜上或細胞內脂質分子的樣品冷凍制備方法、數(shù)據(jù)收集及結果分析，并給出識別不同種類脂質分子的特征碎片離子峰表，列于表1。

在常用的冷凍制樣方法基礎上，Parry等[26]發(fā)明了trehalose基質輔助冷凍斷裂的制樣手段。脫水的trehalose是一種具有高粘度的玻璃態(tài)物質，可以阻止細胞組分的移動和擴散，從而使細胞有效地“凍結”在某一狀態(tài)。 將細胞在含有trehalose的環(huán)境中孵化后進行冷凍，在超高真空測試條件下干燥并斷裂，然后在室溫下進行 TOF-SIMS成像檢測。結果表明，橫向分辨率小于1 μm時，可以觀察到細胞亞結構。由于trehalose基質取代了冰，在常規(guī)冷凍制樣過程中，不存在水重新在樣品表面結冰的現(xiàn)象，溫度不再需要嚴格控制，因此，樣品的檢測可以在室溫下進行，從而大大簡化了TOF-SIMS的實驗操作，增大了TOF-SIMS成為一種常規(guī)生化分析工具的可能。

另外， 在細胞膜研究中，除采用冷凍樣品制備方法外，Sjovall等[27]發(fā)明了將細胞膜較為完整地轉移到Ag表面的“印記”(imprint)方法。將Ag箔放置在被細胞覆蓋的玻璃襯底上，使用彈性高分子半球從Ag箔背面施加幾秒鐘的壓力，然后，使用TOF-SIMS在常溫下對“印”在Ag箔上的細胞膜成分分布進行成像觀察。Sjovall觀察了磷脂酰膽堿(卵磷脂)與膽固醇的相對空間分布， 發(fā)現(xiàn)高濃度膽固醇分布在質膜上，而磷脂酰膽堿傾向于分布在核膜處。

表1 常見脂質分子的碎片離子峰[25]

在細胞內生物成分及其空間分布的研究中，斷開/切開細胞而使其內部成功地暴露于表面的樣品制備是TOF-SIMS實驗的關鍵。常用的斷開/切開細胞實驗手段包括冷凍斷裂[28-29]和聚焦離子束(FIB)切割(milling)單個細胞。Szakal等[30]報道了TOF-SIMS表征完整哺乳動物細胞表面及在亞微米尺度上細胞內的元素、分子及自身細胞膜標記分子的分布。在這項研究中，使用Ga+聚焦離子束切開單個細胞，觀察到了細胞內部的高蛋白質背景。

應用半定量TOF-SIMS成像技術對單個細胞的研究也有報道。 Ostrowski等[6]首先使用原位熒光顯微鏡定位2種J774細胞，然后使用TOF-SIMS表征單個細胞上膽固醇的相對含量。其中一種細胞經過膽固醇與β-環(huán)糊精的預制配合物(Chol-BCD)處理而含有更高的膽固醇含量。 在m/z366～370范圍內的膽固醇碎片離子峰被用于表征膽固醇分布及定量分析。該研究以C5H9(m/z69)峰為內標，采用內標法定量分析。膽固醇碎片峰面積與該峰面積的比值作為歸一化(normalization)結果。C5H9+是由脂質脂肪酸側鏈所產生的一般性碎片，如果忽略基底效應，其強度對于處理和未處理的J774s細胞沒有變化。結果表明，經過Chol-BCD處理后，J774 細胞膜的膽固醇含量增加(135±34)%。這種相對定量分析方法可以在單細胞水平上評估不同的藥物處理和孵化條件對plasma 膜的化學作用程度，因此, 該方法有望在探索細胞正常生物功能、疾病引發(fā)原因、 抗藥性和疾病治愈方法的研究中提供有價值的信息。

采用等離子體涂層技術使樣品表面金屬化的制樣手段，會增強SIMS檢測過程中生物分子的解吸附和離子化，這種方法也被稱為金屬輔助(MetA)SIMS。 Alterlaar等[31]使用濺射的方法將金粒子涂到成神經細胞瘤細胞培養(yǎng)物樣品后，獲得了高空間分辨率細胞的TOF-SIMS圖像。圖3為幾個選擇的離子圖像，顯示了幾種被測細胞上成分分布的模式，其中已經明確的生物成分為膽固醇和甘油二酯。

注：a～d圖的比例尺為1∶100 μm，e圖的比例尺為1∶10 μm圖3 MetA-SIMS 圖像顯示成神經細胞瘤細胞的內部成分分布Fig.3 Cellular localization of MetA-SIMS selected ion count signals from neuroblastoma cells

1.4 組織切片

應用TOF-SIMS成像技術對組織樣品檢測時，在超高真空條件下，樣品自身的化學性質及組織結構應盡可能保持不變。因此，組織樣品也需要做“固定”處理，以防止離子(如 K, Ca, Na和蛋白質)的擴散。 另外，在做固定處理時，需要避免異物對樣品的污染[32]。較為標準的組織樣品制備方法為快速冷凍加低溫脫水。

TOF-SIMS 成像技術在脂質、 膽固醇、卵磷脂及氨基酸分子的分布方面的研究較多。Toubul等[33]對老鼠大腦切片上脂質、膽固醇、維生素E等生物分子的分布做了TOF-SIMS 成像，示于圖4。 Sjovall等[34]使用Au3+作為一次離子源對經過真空干燥的老鼠大腦冷凍切片進行TOF-SIMS成像表征，圖像顯示出膽固醇與卵磷脂有高度互補性的分布。為了提高組織切片的成像信號強度，還采用添加MALDI制樣劑[35]以及添加金粒子等實驗手段。Altelaar等[31]使用電噴霧方法將MALDI基質沉積到神經組織切片的表面上。這樣，在TOF-SIMS檢測中不僅分子離子峰的強度被大大提高，同時由于基質液滴很小且均勻分散在冷凍切片上，避免了待分析分子被濕潤后有較大的橫向擴散而造成空間分辨率的降低。

對比正常與患病人或動物的組織切片中生物組成的差異或它們空間分布的差異，是探究疾病由來的有效方法。應用TOF-SIMS成像技術研究患病組織的目的在于探索TOF-SIMS成為一種新型疾病診斷手段的可能。目前已有應用TOF-SIMS成像技術研究皮膚的光老化和自然老化作用[36]，直腸癌組織[36-37]，慢性腎疾病人的脂肪性組織[38]和脂肪肝患者的肝組織[39]等報道。Lee等[36]使用TOF-SIMS成像技術對經過不同時間的UV光照后又被活體解剖下來的人皮膚的冷凍切片進行了表征。從圖像可以看出，

注：h～j為正離子圖像；k～n 為負離子圖像；n.三色疊加圖像：C16:0 carboxylate ion (紅色), vitamin E (綠色) 和 [ST d18:1/18:0-H]_ (藍色)；o.老鼠大腦切片的光學成像圖4 老鼠大腦切片的TOF-SIMS離子圖像Fig.4 TOF-SIMS ion images of a sagittal rat brain section

多肽和脂質分子的碎片離子峰隨光照時間不同均有很大變化。例如，在真皮區(qū)域里，與未照射的皮膚相對照，經過24 h UV照射后的皮膚的膠原特異性的羥基脯氨酸 (OH-Pro,m/z86.06, C4H8NO+)信號強度明顯降低，但經過48 h和72 h照射后，又恢復正常水平。在表皮區(qū)域里，經過24 h UV照射后，脂質分子的碎片離子峰(如C5H14NO+，m/z104.12, choline) 強度有很大提高，但經過48 h和72 h照射后維持不變。該研究表明，應用TOF-SIMS 成像技術能夠在空間和時間上觀察皮膚組分的改變。

2 深度剖析

深度剖析是SIMS的另一種操作模式，其檢測需要濺射離子源和一次離子源2個離子束源。濺射離子源產生高束流密度離子束，用于在樣品選定區(qū)域內做掃描式濺射轟擊，使在一定厚度內的物質被逐漸剝離樣品表面；一次離子源產生低束流密度的高聚焦離子束，用于常規(guī)的SIMS譜圖或成像分析。循環(huán)交替式進行轟擊-譜圖采集或轟擊-成像數(shù)據(jù)的采集操作過程，最終得到一系列深度下的譜峰或圖像數(shù)據(jù)。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，可以分析樣品在不同表面深度的化學成分變化(depth profiling)，或化學成分分布的變化，即三維成像。 深度剖析技術最常用于半導體材料表面摻雜元素的成分分析，但這種檢測中刻蝕離子束的束流密度高，檢出的信號為元素離子。而本工作所討論的深度剖析檢測是應用于有機物質(比如高分子材料和生命生物材料)的表征，因此，在采譜或成像檢測之前，刻蝕離子束的轟擊是否已經造成樣品結構的破壞關系到測試的成功與否。為解決樣品易被破壞的問題，近年來儀器制造商不斷開發(fā)團簇離子束轟擊技術，比如使用C60+和SF5+作為刻蝕離子束。一些實驗已經證明了團簇離子束對有機體系具有低損傷效果[40]，理論模擬計算也對在同樣動能下，團簇離子束對有機表面損害程度低于單原子離子束的現(xiàn)象做了合理的解釋。團簇離子束在撞擊樣品表面時，發(fā)生了自身分裂而引起傳輸能量降低，并導致一次離子穿透表面的深度變淺，最終對樣品有較小的破壞作用。 目前，與其他液體金屬團簇離子束相比，C60+離子束更適于應用在生物樣品深度剖析或3D生物成像的研究中，如生物分子、組織、細胞和載藥醫(yī)用高分子涂層等。

2.1 蛋白質及多肽膜

為了探究蛋白質與基底的界面化學特性，Mouhib等[41]對吸附在不同親水性的硅襯底表面的牛血清蛋白(BSA)做了深度剖析檢測和PCA的數(shù)據(jù)分析。深度剖析圖可以看到特征性的分子峰隨著刻蝕深度的變化基本保持穩(wěn)定，直至襯底信號出現(xiàn)后開始衰減。為了研究襯底對蛋白質構象的影響，使用PCA方法對襯底信號出現(xiàn)前的譜圖數(shù)據(jù)進行分析，結果表明，在憎水性硅襯底上主要檢測到憎水性氨基酸， 而在親水性硅襯底上檢測到帶正電荷的親水性氨基酸。

Cheng等[42]將多肽分子與trehalose混合，并使用旋涂手段制備成薄膜，并以此為模型體系研究在三維空間里表征生物體系的最佳儀器構造和測量參數(shù)。結果表明，C60團簇離子束與trehalose基質的聯(lián)合使用，使得多肽分子的分子離子峰強度在深度剖析過程中基本保持不變。他們認為刻蝕速度大于化學損傷速度是導致分子離子峰強度保持穩(wěn)定的原因。

2.2 細胞和組織切片的生物成分深度分布及三維成像

Breitenstein等[43]使用Bi3+作為取譜或成像的一次離子束，C60+為轟擊離子束對NRK細胞(正常老鼠腎臟克隆52E)做三維微區(qū)檢測。樣品的制備采用戊二醛和甲醇/醋酸的化學固定方法。從被轟擊到一定深度的XY斷面圖像可以清楚的看到卵磷脂分子和氨基酸分子的分布。但在三維圖像中，細胞看起來在Z方向上有所變形，即使經過數(shù)學矯正處理，Z方向上的變形依然沒有明顯改善。另外，Breitenstein對溴乙啡錠二聚體(核酸熒光探針)標記的細胞做了三維檢測，對比共聚焦激光掃描顯微鏡圖像發(fā)現(xiàn)，熒光探針分子不能被TOF-SIMS三維所表征。

Malmberg等[44]分別使用SF5+和C60+為轟擊離子束，Bi3+為一次離子束對單個培養(yǎng)細胞和完整的腸道上皮細胞組織做三維成像表征。 C60+轟擊組織產生的圖像顯示，膽固醇分子在最表層，并隨深度增加而降低。對比轟擊與未轟擊的樣品，發(fā)現(xiàn)膽固醇分子的分布沒有明顯改變，但是膽堿磷酸分子卻受到轟擊的影響而峰強減弱。使用SF5+和C60+轟擊單細胞后，可觀察到膽堿磷酸分子的碎片峰，而C60+轟擊效果受細胞環(huán)境中鹽份的影響小于SF5+。

Jones等[45]使用40 keV C60+離子束做轟擊，Au+離子束做質譜分析，對老鼠大腦切片完成了深度剖析實驗。此項工作探究了在超出靜態(tài)極限條件下，即高C60+束流密度下，離子束被正確用于研究生物樣品的可能性。希望在不損傷樣品的前提下，通過高束流密度轟擊來提高二次離子產額，從而改善檢出限并獲得較小且有價值的橫向空間分辨率。在實驗中發(fā)現(xiàn)，樣品中的鹽分子對C60+轟擊有較大影響，比如，脂質分子信號降低，而Na 和 K的加和離子(adducted ions)強度增加。因此，采用甲酸銨清洗方法對樣品進行除鹽份的處理，從而除去干擾。組織切片經過了約4 μm深度刻蝕的深度剖析結果示于圖5?？梢钥吹?，在刻蝕深度內，氨基酸信號相對穩(wěn)定(圖5a),但是膽固醇信號卻似乎可分成2個區(qū)域(圖5b中m/z184 曲線)。另外，3D圖像顯示，膽固醇信號(m/z184離子)在灰物質區(qū)域開始較強，但隨后降低至零，而在白色物質區(qū)域其強度卻一直增高。

注：a.氨基酸信號，alanine亞胺離子m/z 44，proline m/z 70, m/z 56 為來自鋼襯底的Fe+ ；b.膽固醇信號m/z 369和 m/z 184；c.轟擊坑AFM 的圖片，坑的深度為4 μm；d～f為3D圖像，其中d為膽固醇m/z 369信號， e為膽固醇m/z 184信號， f為氨基酸的亞胺離子圖5 組織切片的深度剖析結果Fig.5 Depth profiling analysis results of a tissue section

2.3 載藥醫(yī)用高分子涂層

Braun等[46]對涂在心臟支架表面的含有紫杉醇聚(苯乙烯-β-異丁烯-β-苯乙烯)三嵌段共聚物膜做了深度剖析研究。用15 keV Ga+和 20 keV C60+兩種離子源，既作為一次離子源又作為轟擊離子源。由于實際支架在測試腔體內的對準和對其檢測區(qū)域的選擇較為困難，所以使用涂在PET襯底上的高分子涂膜替代支架樣品。這些涂膜經過多重檢測手段的分析，證明與支架上的涂層一樣。實驗結果發(fā)現(xiàn)，使用Ga+不僅不能檢測到紫杉醇的分子峰，而且由于荷電效應嚴重，也不能獲得深度剖析曲線。而使用C60+離子源可獲得較強的紫杉醇分子離子峰。從紫杉醇和高分子基底的深度分布曲線可以清楚看出，紫杉醇分子在表面有輕度的富集現(xiàn)象，而高分子的分布隨深度的變化基本保持穩(wěn)定。另外，C60+離子源的轟擊可有效去除常污染表面的 PDMS分子層，卻不影響下面材料的化學性質。轟擊坑深度可達2 μm，并且從AFM和輪廓儀圖像上可以看出，坑底上沒有發(fā)生相轉移和大的形貌改變，證明轟擊過程中樣品臺不需轉動。

3 TOF-SIMS在生物生命材料領域應用的展望

如果以對科學問題回答的結果及回答過程的簡易程度來作為評估方法實用性的標準，那么TOF-SIMS 的表面質譜和化學成像功能有望成為常規(guī)的生物生命科學分析的表征手段。它們可以用于對分布在材料表面的分子進行結構鑒定和二維分布的表征，作為生物芯片制備過程的檢查手段，用于對細胞及組織切片中脂質分子和其他生物分子的二維表征。但是，深度剖析技術對生物樣品表征的實用性還有待更多的探討。

在表面質譜對有機結構表征的應用方面，TOF-SIMS儀器有優(yōu)異的質量分辨率(約8 000 u), 這使得TOF-SIMS譜圖數(shù)據(jù)能提供精確的分子質量及同位素分布信息，進而可用于確認樣品中未知成分的化學式。為了開發(fā)TOF-SIMS對樣品中未知的有機和生物分子的結構鑒定潛能，需要建立有機分子和生物分子的譜圖數(shù)據(jù)庫。另外，雖然定量分析方法已被應用于醫(yī)用高分子的生物降解機理等方面的研究，但其應用范圍還需進一步的拓展。在化學成像的應用方面，提高空間分辨率和分子離子峰的產額仍然是儀器制造人員努力的目標。如果分子離子峰圖像的信噪比可以大程度的增強，則可以直接使用分子離子峰對生物芯片的化學反應進行觀察，而不再局限于使用無特異性的小碎片離子峰(如CN-、POx-、CnHn-及SOx-等)間接地表征帶有氨基、磷酸基、硫及飽和碳氫的化合物。在生物質譜成像方面，與TOF-SIMS相似的是MALDI成像。相比于MALDI成像，TOF-SIMS的優(yōu)點是有較高的空間分辨率 (亞微米)，而MALDI的空間分辨率在30～100 μm范圍內。然而MALDI成像的優(yōu)點是它的離子產額遠遠高于TOF-SIMS，特別是有較高荷質比的離子峰也會有較為合適的離子產額，能夠產生信噪比強的圖像。為了克服離子產額低的弱點，除了不斷提高儀器性能外，還可以通過特殊制樣的方法來實現(xiàn)，比如，ME-SIMS， MetA-SIMS技術。另外，如何使生物樣品制備更易操作，使低溫測試所需的配套實施更易實現(xiàn)，也是推廣化學成像應用于細胞和生物組織表征的關鍵問題。

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