楊振宇，周 瑤

(上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135)

近年來，水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象出現(xiàn)在世界許多大水系中。水體出現(xiàn)富營養(yǎng)化現(xiàn)象時(shí)，藻類大量繁殖，產(chǎn)生的一些溶于水的代謝物(如藻毒素)不僅可使水體生物死亡，甚至可以通過飲用水和水產(chǎn)品富集危害人類健康。在水華藻類中，毒性最強(qiáng)、污染范圍最廣的是藍(lán)藻(blue-green algae)。藍(lán)藻廣泛分布于江河、湖沼、海洋等水體中，大多數(shù)藍(lán)藻在代謝過程中能產(chǎn)生各種毒素，其中，微囊藻毒素(microcystin，MC)是藍(lán)藻釋放的一類具有強(qiáng)烈致癌作用的肝毒素和神經(jīng)毒素。

MC是一種環(huán)肽肝毒素，其結(jié)構(gòu)為環(huán)(D-丙氨酸-L-R1-赤-β-甲基-D-異天冬氨酸-L-R2-Adda-D-異谷氨酸-N-甲基脫氫丙氨酸)。其中,N-甲基脫氫丙氨酸(Mdha)是一種特殊的氨基酸，含有α、β不飽和雙鍵；Adda結(jié)構(gòu)為3-氨基-9-甲氧基-2，6，8-三甲基-10-苯基-4，6-二烯酸，是MC生物毒性表達(dá)所必需的；R1、R2為2種可變L-氨基酸，由于R1、R2位置上的氨基酸不同，環(huán)狀結(jié)構(gòu)不同位置側(cè)鏈的不同，以及側(cè)鏈上甲基化/去甲基化產(chǎn)生的差異，可以形成多種不同結(jié)構(gòu)。目前已從不同微囊藻菌株中分離鑒定了近80種MC結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)將檢測(cè)的7種MC結(jié)構(gòu)中R1與R2的氨基酸種類列于表1。

表1 7種MC結(jié)構(gòu)中R1與R2的氨基酸種類

MC具有水溶性和耐熱性，易溶于甲醇，可溶于水。由于環(huán)狀結(jié)構(gòu)和間隔雙鍵，其結(jié)構(gòu)具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性[1-2]。肝臟是MC主要的靶器官，所以肝毒性是MC的主要毒性，在低濃度時(shí)就有專有肝毒性和癌誘發(fā)活性。同時(shí)，MC也表現(xiàn)出胚胎發(fā)育、免疫、遺傳等方面的毒性[1-3]。MC不僅能直接導(dǎo)致一些水生生物(如魚類、貝類及蚌類)患病及死亡，而且一些野生動(dòng)物及家畜飲用了含有藻毒素的水后，會(huì)引起中毒甚至死亡，同時(shí)還可能通過食物鏈的生物富集危害人類的健康。

MC的檢測(cè)方法較多[4-6]，可分為液相檢測(cè)方法[7-8]、生物學(xué)方法[9]和免疫檢測(cè)法[10-11]等。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜由于定性準(zhǔn)確、定量靈敏，是微量毒素分析最有效的檢測(cè)技術(shù)[11-18]。本實(shí)驗(yàn)擬采用固相萃取和基質(zhì)分散固相萃取兩種前處理方法，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)水產(chǎn)品中7種MC。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

TSQ Quantum Ultra液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國Thermo-Fisher公司產(chǎn)品，配有Accela液相色譜儀；Allegla X-22R高速離心機(jī)：美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品；PT2100均質(zhì)儀：Poly TRO公司產(chǎn)品；QGC-12T氮吹儀：上海泉島公司產(chǎn)品；890/H超聲儀：德國Elma公司產(chǎn)品；KMC-1 300 V渦旋振蕩器： Vision公司產(chǎn)品；固相萃取裝置：美國Supelco公司產(chǎn)品；Waters Oasis HLB固相萃取小柱：美國Waters公司產(chǎn)品；DSPE PSA/C18 MSPD基質(zhì)分散固相萃取管：德國CNW公司產(chǎn)品；水相針式濾膜(聚醚砜材質(zhì)，13 mm×0.22 μm)：德國CNW公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料和試劑

水：滿足GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水要求；甲醇：色譜純；甲酸：色譜純，含量≥98%；正己烷：分析純。

MC標(biāo)準(zhǔn)品(MC-RR、LR、YR、LA、LW、LF、LY微囊藻毒素固體標(biāo)準(zhǔn))： 瑞士Alexis公司產(chǎn)品。MC-RR、MC-LR為0.1 mg，其它均為0.025 mg，使用前用甲醇稀釋，配成7種MC混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，20%甲醇定容。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1色譜條件 色譜柱：Hypersil GOLD C18 (50 mm×2.1 mm×1.9 μm)；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)；梯度洗脫程序：0～3 min、20%B，3～5 min、20%～95%B，5～5.1 min、95%～20%B，5.1～7 min、20%B。

1.3.2質(zhì)譜條件 電噴霧正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，噴霧電壓3.5 kV，噴霧溫度300 ℃，鞘氣氣壓30，輔助氣壓10，毛細(xì)傳輸管溫度270 ℃。母離子、子離子和相關(guān)參數(shù)列于表2。

1.4 前處理方法

1.4.1樣品勻漿 準(zhǔn)確稱取2 g淡水產(chǎn)品的食用部分于50 mL離心管中，加入5 mL 80%甲醇水溶液，勻質(zhì)器上以20 000 r/min混合1 min，使樣品均質(zhì)成勻漿，然后超聲15 min，以4 000 r/min離心5 min。

1.4.2固相萃取法(SPE) 將1.4.1離心后的上清液轉(zhuǎn)移至試管中，70 ℃氮吹至約0.5 mL，加水至約10 mL，待SPE柱凈化。HLB固相萃取小柱在使用前應(yīng)分別用5 mL甲醇和水以1～2 mL/min流速淋洗活化，活化后的小柱應(yīng)盡快使用。將10 mL樣液轉(zhuǎn)移到HLB小柱上，控制上樣流速為1～2 mL/min；用5 mL 10%甲醇以1～2 mL/min流速淋洗，抽干；用5 mL 80%甲醇溶液以1 mL/min流速洗脫；收集洗脫液，并于70 ℃下氮吹至近干；最后用20%甲醇水溶液定容至1 mL，過0.22 μm濾膜，供液相色譜-質(zhì)譜儀測(cè)定。

表2 7種MC分析物的母離子、子離子和相關(guān)參數(shù)

注：*為定量離子

1.4.3基質(zhì)分散固相萃取法(MSPD) 將1.4.1離心后的上清液轉(zhuǎn)移到DSPE PSA/C18 MSPD基質(zhì)分散固相萃取管中，振搖2 min，以4 000 r/min離心5 min，取全部上清液至10 mL比色管中，用水定容至5 mL。混勻后，取1 mL溶液過0.22 μm濾膜，供液相色譜-質(zhì)譜儀測(cè)定。

2 結(jié)果和討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

配制10 mg/L的MC標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別對(duì)每個(gè)MC標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子和子離子的參數(shù)優(yōu)化。

由于ESI離子源是一種軟電離方式，大部分目標(biāo)化合物會(huì)形成1價(jià)離子，也可能形成2價(jià)離子、多價(jià)離子或者其他加合離子。由表2可以看出，大部分MC主要形成加氫的1價(jià)正離子，但MC-RR的離子形成與其他離子不同，它產(chǎn)生2價(jià)離子的產(chǎn)率要比形成其他離子的高，所以選用m/z519.8[M+2H]2+作為MC-RR母離子。

子離子以m/z135、213、375為主，這3種子離子都是MC的特征子離子，具體分子式和結(jié)構(gòu)見表3和圖1。m/z135是MC的共有基團(tuán)3-氨基-9-甲氧基-2，6，8-三甲基-10-苯基-4，6-二烯酸(Adda)的甲氧鍵斷裂形成的特征碎片，它在MC-LR、MC-RR、MC-YR子離子質(zhì)譜圖上的豐度最大，其他MC的子離子也含有此離子。另外，m/z213、375也是大部分MC共有結(jié)構(gòu)的特征碎片，所以本實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)的7種MC的子離子也都有這2種質(zhì)量數(shù)的碎片。MC-RR、LR、YR將m/z135作為定量離子，其他4種MC用m/z375作為定量離子。

為了得到較高的離子化效率，在使用ESI離子源時(shí)，需加入一些離子化增強(qiáng)試劑。本實(shí)驗(yàn)采用甲酸作為離子化試劑，并對(duì)流動(dòng)相中的甲酸含量進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，不同甲酸濃度對(duì)靈敏度的影響示于圖2。

表3 子離子的分子式

圖1 3種子離子可能的碎裂方式Fig.1 The possible fragmentation of daughter ions

圖2 不同甲酸濃度對(duì)靈敏度的影響 Fig.2 Effect of different concentrations of formic acid on sensitivity

從圖2可以看到，加入甲酸后，MC-LA、LY、LF、LW的靈敏度大大增加，但在0.1%和0.2%甲酸含量水平，靈敏度變化不大。所以采用在流動(dòng)相中添加0.1%甲酸，優(yōu)化后的總離子流圖和定量離子色譜圖示于圖3。

2.2 前處理方法的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)[2]和MC本身的特性，SPE柱一般用C18小柱或者HLB小柱凈化和富集樣品。本實(shí)驗(yàn)對(duì)HLB小柱的淋洗條件做了回收實(shí)驗(yàn)，步驟如下：在活化的HLB小柱上，上樣10 mL含7種MC的水樣，其中每種MC各20 ng，然后分別用5 mL 100%水、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%甲醇水溶液、100%甲醇進(jìn)行洗脫，分別收集洗脫液，上機(jī)測(cè)量MC含量，并計(jì)算洗脫液中7種MC含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：RR在50%～80%甲醇水淋洗段被淋洗下來；YR、LR、LA、LF、LW、LY在20%～80%甲醇水淋洗段被淋洗下來。所以本實(shí)驗(yàn)使用10%甲醇水溶液淋洗，80%甲醇水溶液洗脫。

目前，基質(zhì)分散固相萃取方法(matrix solid phase dispersion，MSPD)已被用于多種殘留分析的前處理[19-20]，在MC檢測(cè)中，MSPD也有一些應(yīng)用[21-22]。

本實(shí)驗(yàn)采用CNW公司的DSPE PSA/C18 MSPD基質(zhì)分散固相萃取管。這是一根容積為15 mL的離心管，里面灌裝了150 mg PSA、150 mg C18、900 mg無水硫酸鎂等固體粉末。當(dāng)樣品的甲醇水提取液倒入MSPD管，C18會(huì)吸附其中的非極性物質(zhì)，PSA(乙二胺-N-丙基)會(huì)吸附脂肪酸、有機(jī)酸、極性色素、糖類等物質(zhì)，硫酸鎂則會(huì)吸附水，同時(shí)吸附水溶性雜質(zhì)，而MC則會(huì)留在甲醇溶液中，從而達(dá)到凈化的目的。需要指出的是，該凈化效果不如過柱法好，檢出限差，回收率相對(duì)較低，但該過程的檢測(cè)時(shí)間短、操作方便、檢出限符合要求，是快速簡(jiǎn)便的方法。

2.3 方法指標(biāo)

根據(jù)不同前處理方法導(dǎo)致的不同檢出限，設(shè)置了不同的添加水平，對(duì)水產(chǎn)品中MC進(jìn)行回收率和精密度實(shí)驗(yàn)。SPE法的添加水平為0.5、1、2 μg/kg；MSPD法的添加水平為2.5、5、10 μg/kg，對(duì)應(yīng)上機(jī)溶液中的MC含量水平為1、2、4 μg/L。選取了均為陰性樣品的筍殼魚肉和螄螺肉作為添加樣品基質(zhì)，平行測(cè)量6次，結(jié)果列于表4。

由表4可以看到出：SPE法的回收率為75%～106%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于20%；MSPD法的回收率為73%～93%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于19%。

圖3 7種MC的色譜圖Fig.3 Chromatograms of 7 MCs

MC名稱SPE法回收率/%相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差/%MSPD法回收率/%相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差/%RR77～98<2073～85<15YR75～93<1673～89<13LR81～96<1082～93<16LA78～102<1375～90<19LF83～106<1277～91<12LW86～96<1380～89<8LY82～93<1078～93<11

3 結(jié)論

建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定動(dòng)物源性水產(chǎn)品中7種MC的方法，7種MC在0.5～20 μg/L范圍內(nèi)線性良好。根據(jù)動(dòng)物源性水產(chǎn)品樣品的情況，建立了SPE和MSPE兩種前處理方法。SPE法操作較繁瑣，測(cè)量過程較長(zhǎng)，但檢測(cè)限較低，為0.5 μg/kg，添加回收率為75%～106%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于20%；而MSPD法操作簡(jiǎn)單，但檢測(cè)限則不如SPE法，為2.5 μg/kg，添加回收率為73%～93%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于19%。因此，可以根據(jù)實(shí)際要求，選取不同的前處理方法進(jìn)行檢測(cè)。

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