沈迪△  李崇慧▲  周晉華  徐海惠 周鵬飛

[摘要] 目的 觀察復(fù)方守宮散對(duì)Lewis肺癌小鼠JAK2-STAT3信號(hào)通路的影響。 方法 將55只C57BL/6J小鼠按常規(guī)方法接種Lewis肺癌瘤株，6d后選取荷瘤成功的小鼠50只隨機(jī)分為5組：陽性對(duì)照組、西藥組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組，每組10只。陽性對(duì)照組：灌服生理鹽水0.2mL，1次/d；中藥組灌服復(fù)方守宮散高劑量組0.6mL（相當(dāng)于120mg/kg），中劑量組0.4mL（相當(dāng)于60mg/kg），低劑量組0.2mL，（相當(dāng)于40g/kg），1次/d；順鉑組按1mg/kg給藥，0.1mL/只腹腔注射。每天1次，共14d。在光鏡下用HE染色法觀察腫瘤組織病理形態(tài)學(xué)改變情況，用Western Blot法檢測(cè)JAK2、STAT3蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果 各給藥組JAK2、STAT3蛋白的表達(dá)水平出現(xiàn)不同程度降低，且JAK2降低較為明顯。 結(jié)論 復(fù)方守宮散能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)，降低 Lewis瘤細(xì)胞中JAK2、STAT3蛋白的表達(dá)，并通過此方式阻斷JAK2-STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 。

[關(guān)鍵詞] 肺癌；信號(hào)通路；實(shí)驗(yàn)研究

[中圖分類號(hào)] R734.2???[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A???[文章編號(hào)] 2095-0616（2014）09-17-05

Study on the effects of Compound Shougong Powder on the JAK2-STAT signaling pathway of mice with Lewis lung carcinoma

SHEN?Di1??LI?Chonghui2??ZHOU?Jinhua2??XU?Haihui1??ZHOU?Pengfei1

1.Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230000, China; 2.Department of Oncology, First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230000, China

[Abstract] Objective To observe the effects of Compound Shougong Powder on the JACK2-STAT3 signaling pathway of mice with Lewis lung carcinoma. Methods 55 C57BL/6J mice were inoculated with tumor cell lines of Lewis lung carcinoma via a conventional method. 50 tumor-bearing mice were selected after six days and assigned to five groups: a positive control group, a western medicine group, a TCM group with high dosages, a TCM group with medium dosages, and a TCM group with low dosages, with 10 mice in each group. The positive control group was orally given normal saline of 0.2 mL once a day; the TCM groups were orally given compound shougong powder of 0.6mL for the group with high dosages (equal to 120 mg/kg), 0.4mL for the group of medium dosages (equal to 60mg/kg), and 0.2 mL for the group with low dosages (equal to 40 mg/kg) once a day; the Western medicine group was intraperitoneally injected with cisplatin of 1 mg/kg, 0.1mL each, once a day for 14 days. Pathological and morphological changes of tumor tissues were observed via HE staining under light microscope, and expression levels of JAK2 and STAT3 proteins were tested via the Western Blot. Results Expression levels of JAK2 and STAT3 proteins in each group decreased with different degrees, and the decrease of JAK2 was relatively significant. Conclusion Compound Shougong Powder inhibits tumor growth, lowers the expression of JAK2 and STAT3 proteins in Lewis tumor cells, and in such way blocks the JACK2-STAT3 signaling pathway.

[Key words] Lung carcinoma; Signaling pathway; Experimental study

肺癌是對(duì)人類健康和生命危害最大的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）所占比例高達(dá)85％?；熢谥型砥诜切〖?xì)胞肺癌的治療中發(fā)揮著重要作用，但且化療藥物毒副作用較大，使許多中晚期非小細(xì)胞肺癌患者難以堅(jiān)持完成化療。在

我國(guó)，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)結(jié)合中醫(yī)藥治療肺癌是一大特色，臨床應(yīng)用有效，本實(shí)驗(yàn)將Lewis廇小鼠作為研究體系，觀察了中藥與西藥作用后癌基因STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白JAK2 、STAT3 的表達(dá)，為中醫(yī)藥的臨床運(yùn)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞

C57BL/6J小鼠50只，體重（20±2） g，雄性，由安徽醫(yī)科大學(xué)二附院動(dòng)物房提供（動(dòng)物許可證號(hào)：晥20130017 ） 。小鼠Lewis肺癌細(xì)胞（ Lewis lung cancer cell line，LLC）， 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫提供。

1.2?模型建立

細(xì)胞培養(yǎng)：復(fù)蘇小鼠Lewis肺癌細(xì)胞，貼壁生長(zhǎng)于DMEM培養(yǎng)液中（含10%滅活胎牛血清及100U/mL青霉素、鏈霉素），置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。約3d傳一代，用0.25%胰酶消化。正常傳3代后，胰蛋白酶消化法制成細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞率＞95%，用PBS液調(diào)整活細(xì)胞濃度為2×107/mL，取0.2mL瘤細(xì)胞懸液接種于每只C57BL/6J小鼠右側(cè)前肢腋下皮下。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)固體混合飼料喂養(yǎng)。接種6d后，以小鼠右側(cè)前肢腋下皮下可觸及米粒大小腫瘤塊，標(biāo)志造模成功。

endprint

1.3?分組與給藥

隨機(jī)分為陽性對(duì)照組、高劑量復(fù)方守宮散組、中劑量守宮散組、低劑量守宮散組、順鉑組，每組10只。實(shí)驗(yàn)第2天（造模成功24h后），陽性對(duì)照組：灌服生理鹽水0.2mL，1次/d；中藥組灌服復(fù)方守宮散高劑量組0.6mL（相當(dāng)于120mg/kg），中劑量組0.4mL（相當(dāng)于60mg/kg），低劑量組0.2mL（相當(dāng)于40g/kg），1次/d；順鉑組按1mg/kg給藥，0.1mL/只腹腔注射。每天1次，共14d。

1.4?藥品與試劑

（l）復(fù)方守宮散（安徽省中醫(yī)院中藥房）。（2）順鉑（江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H200408l3，產(chǎn)品批號(hào)070902）。（3）①電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒：美國(guó)pierce公司 ；②actin（購自北京中山公司）；③DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司生產(chǎn)）；④ 山羊抗兔二抗 、JAK2、STAT3（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；⑤10%胎牛血清（杭州四季青生物制品有限公司）。

1.5?實(shí)驗(yàn)器材

水浴恒溫振蕩器，湘儀高速離心機(jī)，生物安全柜，光學(xué)顯微鏡，包埋機(jī)，手動(dòng)石蠟切片機(jī)，攤片機(jī)，烘片機(jī)，智能化組織脫水機(jī)，電子天平，高速冷凍離心機(jī)，電泳儀，凝膠自動(dòng)成像及分析系統(tǒng)等。

1.6?觀察指標(biāo)

1.6.1?腫瘤抑制率?停藥后第2日處死動(dòng)物，完整剝?nèi)∧[瘤，稱重量，計(jì)算腫瘤抑制率。抑瘤率=（對(duì)照組平均瘤重-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重）/對(duì)照組瘤重×100%。

1.6.2?瘤組織JAK2、STAT3蛋白測(cè)定?采用Western blot 法。剪取腫瘤組織，稱重，每個(gè)樣品重量在100mg左右，加入RIPA細(xì)胞裂解液1mL（內(nèi)含1mM PMSF）進(jìn)行裂解。離心，收集上清液，即含有組織總蛋白。在收集的蛋白樣品中加入等量的2X SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。沸水浴加熱10min，以充分變性蛋白。待樣品冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)。每孔加15μL。濃縮膠所用電壓為80V，時(shí)間為30min；分離膠所用電壓為120V，時(shí)間為1h。將預(yù)先裁好與膠條同樣大小的濾紙和PVDF膜（預(yù)先在甲醇中浸泡3min），浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中5min。接通電源，恒流轉(zhuǎn)膜。5%BSA在搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫封閉2h。分別用一抗：抗beta-actin抗體，抗體屬性為鼠抗；1︰1000稀釋，10%的分離膠；抗Jak2、Stat3抗體屬性為兔抗；1︰1000稀釋，10%的分離膠抗。4℃緩慢搖動(dòng)孵育過夜。加入洗滌液（TBST），每次洗滌10min，共洗滌3次。HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗1︰10000稀釋液稀釋，室溫封閉2h。加入洗滌液（TBST），每次洗滌10min，共洗滌3次。用ECL發(fā)光試劑盒說明來檢測(cè)蛋白。

1.7?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料采用（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用取LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?腫瘤組織病理切片結(jié)果

（1）目檢：肉眼觀移植瘤有完整包膜，易分離，腫瘤組織血供豐富，無明顯周圍組織和皮膚浸潤(rùn)，切面呈魚肉樣；（2）鏡檢：模型組：腫瘤細(xì)胞呈巢狀，彌漫大片狀分布，腫瘤細(xì)胞排列不規(guī)則，體積大，核大深染，異型性明顯，核分裂相較治療組多見，間質(zhì)血管豐富，腫瘤組織中可見小灶性壞死，可見血管內(nèi)瘤栓形成，侵犯周圍肌肉及脂肪組織。其余治療各組：DDP組腫瘤組織呈巢狀、彌漫小片狀分布，凝固性壞死面積較大，腫瘤細(xì)胞核固縮較中藥組腫瘤組織明顯，腫瘤細(xì)胞核分裂相減少，見大量核碎裂，血竇豐富，可見腺樣良索狀分布，中藥各組均可見彌漫大片狀分布腫瘤細(xì)胞，可見小灶性壞死，可見大量深染細(xì)胞核，巨核細(xì)胞、多核細(xì)胞。見圖1~5。

圖1??灌服生理鹽水陽性對(duì)照組（HE×400）

圖2

圖3

圖4

圖5

注：HE×400，圖1表示灌服生理鹽水陽性對(duì)照組，圖2表示灌服西藥順鉑組，圖3表示灌服中藥復(fù)方守宮散高劑量組，圖4表示灌服中藥復(fù)方守宮散中劑量組，圖5表示灌服中藥復(fù)方守宮散低劑量組

2.2?對(duì)小鼠腫瘤的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束前稱小鼠體重，脫臼處死小鼠后，迅速剝離瘤體，稱重，計(jì)算抑瘤率。結(jié)果表明：各實(shí)驗(yàn)組對(duì)瘤重均具有一定的抑制作用，與陽性對(duì)照組比較瘤重明顯減輕，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。西藥組與中劑量、低劑量中藥組比較，西藥組瘤重較輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。中藥各組間比較，隨著中藥劑量的提高，抑瘤率逐漸提高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。以上結(jié)果說明復(fù)方守宮散對(duì)肺癌小鼠有抑瘤作用，5組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。數(shù)據(jù)見表1。

表1??各組瘤重及抑瘤率比較（）

組別 n

（起始總數(shù)/存活數(shù)） 平均瘤重

（g） 抑瘤率

（%）

陽性對(duì)照組 10/7 2.91±0.24 -

DDP組 10/8 1.29±0.07* 55

中藥高劑量組 10/8 1.42±0.06*# 51

中藥中劑量組 10/8 1.58±0.06*#▲ 46

中藥低劑量組 10/8 1.82±0.05*#▲△ 37

注：每組抑瘤率（%）=（對(duì)照組瘤重 - 實(shí)驗(yàn)組瘤重）/ 對(duì)照組瘤重×100%。與對(duì)照組比較， *P＜0.05，與DDP組比較，#P＜0.05；與中藥高劑量比較，▲P＜0.05；與中藥中劑量組比較，△P＜0.05

2.3?免疫印跡法檢測(cè)各組JAK2 STAT3蛋白含量

JAK2、STAT3蛋白表達(dá)的免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示：陽性對(duì)照組蛋白條帶顏色較明顯，JAK2、STAT3表達(dá)水平較高；DDP組蛋白條帶顏色與中藥各組相比顏色較淺，JAK2、STAT3表達(dá)水平較低；中藥各組隨著劑量的增加蛋白條帶顏色變淺，JAK2、STAT3表達(dá)水平逐漸降低。各組蛋白平均灰度值見表2，蛋白表達(dá)見圖6。

3?討論

復(fù)方守宮散是我科多年臨床經(jīng)驗(yàn)成方藥，主要由人參、何首烏、三七、守宮、綠萼梅組成，臨床觀察可以緩解改善晚期肺癌的生活質(zhì)量，緩解疼痛，亦

表2??JAK2、STAT3蛋白的平均灰度值（）

組別 JAK2 STAT3

陽性對(duì)照組 1.15994465±0.078114445 1.601687904±0.001737841

DDP組 0.22111620±0.052118456 0.843041454±0.02331237

中藥高劑量組 0.33721824±0.056273485* 1.057710655±0.027987233

中藥中劑量組 0.60361609±0.047016882* 1.140041643±0.027435129

中藥低劑量組 0.96174943±0.056689694** 1.347452717±0.040262261

注：與陽性對(duì)照組比較，*P＜0.05；與陽性對(duì)照組比較，**P＞0.05

DDP高 中低 陽

Actin

JAK2

STAT3

圖6??順鉑組，中藥高、中、低劑量組的JAK2，STAT3蛋白表達(dá)量與標(biāo)準(zhǔn)Actin蛋白表達(dá)的比較

endprint

能降低化療毒副反應(yīng)作用。現(xiàn)在藥理研究表明灌服鮮壁虎凍干粉的小鼠含藥血清對(duì) C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡的作用，認(rèn)為其機(jī)制可能與上調(diào) bax基因有關(guān)[1]。守宮中分離得到的硫酸守宮多糖與人肝癌細(xì)胞BEL-7402共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞由多邊形變?yōu)榧忓N形，并且肝癌細(xì)胞甲胎蛋白分泌量減少，而轉(zhuǎn)氨酶分泌量增多，同時(shí)經(jīng)流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)癌細(xì)胞被阻滯于G2，M期，因此認(rèn)為硫酸守宮多糖可誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞分化[2]。人參中的有效成分人參皂苷具有多種藥理作用，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞信號(hào)通路系統(tǒng)、降低腫瘤細(xì)胞端粒酶活性增強(qiáng)機(jī)體免疫力提高抗腫瘤能力以及阻斷腫瘤細(xì)胞某些重要成分的合成與代謝等[3]；三七含有天然多糖物質(zhì)，對(duì)腫瘤細(xì)胞有抑制作用[4]，三七活性成分Rh2、Rg3在抑制腫瘤細(xì)生長(zhǎng)的同時(shí)，能夠保護(hù)荷瘤小鼠的免疫器官并增強(qiáng)免疫功能，提高免疫小鼠的免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌，從多方面發(fā)揮抗腫瘤作用[5]；何首烏中大黃素具有抑菌、抗炎、保護(hù)肝腎功能、改善微循環(huán)、抗腫瘤等作用[6]。

JAK2/STAT3信號(hào)通路在多種腫瘤組織和細(xì)胞系中持續(xù)激活和異常表達(dá)，能夠促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲、血管生成和轉(zhuǎn)移[7]。已有多項(xiàng)研究結(jié)果證實(shí)JAK2/STAT3信號(hào)通路在多種腫瘤中過度活化，如胃癌、肝癌等，并且該通路與腫瘤組織中的MVD值密切相關(guān)[8-9]。

STAT3是JAKs的直接底物，能將信號(hào)直接傳遞到核內(nèi)，調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)，目前研究最多的是STAT3和STAT5，STAT3和腫瘤的形成與發(fā)展密切相關(guān)。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（Signal transduction and activators of transcription，STAT3）蛋白大約由770個(gè)氨基酸組成，有三種異構(gòu)體：STAT3α（即一般意義所指的STAT3）、STAT3β和STAT3γ。參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂及分 化等多種正常生理過程[10]。JAK/STAT信號(hào)通路是繼Ras途徑之后又一重要的細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)通路，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)、炎癥、腫瘤等多種病理生理過程中發(fā)揮重要作用。JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)通路異?；罨蓪?dǎo)致細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化。STAT3在多種腫瘤組織與細(xì)胞系中都有異常表達(dá)或活性增強(qiáng) [11]，它的下游靶基因很多都與細(xì)胞增殖、凋亡密切相關(guān)，如Bcl-xl、Bcl-2、Mcl-1以及細(xì)胞周期素、Fas和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子[12-13]等。而STAT3自身又受到細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控。同時(shí)發(fā)現(xiàn)STAT3在許多實(shí)體腫瘤和血液腫瘤中被激活，這可能與STAT3的促生長(zhǎng)作用和抗凋亡作用有關(guān)[14]。所以STAT3的激活可能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制相關(guān)聯(lián)。Niu等[15]發(fā)現(xiàn)阻斷STAT3的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可使VEGF的表達(dá)下調(diào)，且STAT3蛋白可結(jié)合VEGF啟動(dòng)子，提示VEGF基因的表達(dá)是通過STAT3蛋白來調(diào)節(jié)。余祖濱等[16]以脂質(zhì)體為載體將SOCS3基因轉(zhuǎn)染至人肺腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中SOCS3穩(wěn)定表達(dá)，STAT3蛋白酪氨酸磷酸化水平顯著下降，提示SOCS3蛋白可能通過降低STAT3酪氨酸磷酸化水平，抑制NSCLC細(xì)胞的增殖。He等[17]發(fā)現(xiàn)，NSCLC細(xì)胞中SOCS-3基因啟動(dòng)子高度甲基化而失去轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致了STAT3基因表達(dá)的上調(diào)，提示通過高度甲基化阻斷SOCS3轉(zhuǎn)錄，可能是激活癌變過程中的JAK-STAT3途徑的一個(gè)重要機(jī)制。而使SOCS3恢復(fù)表達(dá)之后，能夠?qū)е耂TAT3表達(dá)下調(diào)，誘導(dǎo)癌細(xì)胞調(diào)亡和抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。隨后，在He等[18]的研究中也證實(shí)通過甲基化使SOCS3基因啟動(dòng)子沉默，可促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，抑制其增殖。提示SOCS-3可能成為NSCLC治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各給藥組與陽性對(duì)照組比較腫瘤平均瘤重較低，中藥、西藥對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)均有一定的抑瘤作用，復(fù)方守宮散組與順鉑組比較抑瘤率相對(duì)較低，且與中藥劑量呈正相關(guān)；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示中藥、西藥均可以降低JAK2、STAT3蛋白的表達(dá)，阻斷JAK2-STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，西藥組的表達(dá)量明顯較中藥組低，說明抗腫瘤作用可能是通過降低JAK2、STAT3蛋白的表達(dá)，阻斷JAK-STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)。

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endprint

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[18] He B，You L，Xu Z，et al. Activity of the suppressor ocytokine signalling-3 promoter in human non-small-cell lung cancer[J].Clin Lung Cancer，2004，5（6）：366-370.

（收稿日期：2014-03-03）

endprint

[12] Mora LB，Buettner R，Seigne J，et al.Constitutive activation ofStat3 in human prostate tumors and cell lines：direct inhibition of Stat3signaling induces apoptosis of prostate cancer cells[J].Cancer Res，2002，62（22）：6659-6666.

[13] Ram PT，Iyengar R.G protein coupled receptor signaling through the Src and Stat3 pathway：role in proliferation and transformation[J].Oncogene，2001，20（13）：1601-1606.

[14] Niu G，Wright KL，Huang M，et al.Constitutive Stat3 activity upregulatesVEGF expression and tumor angiogenesis[J].Oncogene，2002，21（13）：2000-2008.

[15] Yeh HH，Lai WW，Chen HH，et al.Autocrine IL-6-induced Stat3 activation contributes to the pathogenesislung adenocarcinoma and m alignant pleural effusion[J].Oncogene，2006，25（31）：4300-4309.

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（收稿日期：2014-03-03）

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[16] 余祖濱，閔家新，白莉，等. SOCS3基因轉(zhuǎn)染對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株A549增殖的影響[J].癌癥， 2004，23（9）：1047-1051.

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[18] He B，You L，Xu Z，et al. Activity of the suppressor ocytokine signalling-3 promoter in human non-small-cell lung cancer[J].Clin Lung Cancer，2004，5（6）：366-370.

（收稿日期：2014-03-03）

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