AMPK/PPARα/SCAD信號途徑對心肌肥大的調(diào)控研究*

黃金賢， 羅佳妮， 劉培慶， 陳少銳， 黃秋菊， 潘雪刁， 臧林泉， 周四桂△

(1廣東藥學院臨床藥學系，廣東 廣州 510006; 2中山大學藥學院藥理與毒理學實驗室，廣東 廣州 510006)

我們采用定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)比較了16周齡自發(fā)性高血壓大鼠和血壓正常大鼠的心肌蛋白質(zhì)組，首次發(fā)現(xiàn)短鏈酰基輔酶A脫氫酶(short-chain acyl-coenzyme A dehydrogenase，SCAD)在自發(fā)性高血壓大鼠肥大心肌中的表達顯著降低[1]。SCAD是脂肪酸β氧化的限速酶，對脂肪酸β氧化起著關(guān)鍵作用。我們的研究進一步證實，SCAD的蛋白表達及酶活性的顯著下調(diào)，可能是導致自發(fā)性高血壓大鼠肥厚心肌能量代謝“胚胎型再演”的分子基礎[2]；體外苯腎上腺素(phenylephrine，PE)刺激誘導的心肌細胞肥大模型中，SCAD在蛋白及mRNA水平均顯著下調(diào)；采用siRNA干擾SCAD后，心肌細胞肥大指標明顯上升，表明SCAD參與了心肌肥大的調(diào)控[3]。然而，SCAD調(diào)控心肌肥大的分子機制尚不清楚。

過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα)是核受體超家族成員，也是脂肪酸氧化酶基因的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控子。研究證實，與野生型小鼠相比，PPARα-/-小鼠心肌中SCAD蛋白表達顯著下調(diào)，且心肌對脂肪酸攝取、氧化能力下降，表明SCAD基因的表達受PPARα調(diào)控。已有大量的研究證明，心肌肥大過程伴隨著PPARα的表達下調(diào)[4-6]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，PPARα受體激動劑非諾貝特可能通過上調(diào)SCAD的表達抑制大鼠心肌肥大，改善心肌能量代謝障礙[7-8]。

腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase， AMPK)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，參與不同的生理及病理過程中細胞能量代謝的調(diào)控。研究表明，AMPK可通過激活PPARα信號通路，從而抑制心肌肥大[9]。因此，探討AMPK/PPARα/SCAD信號途徑是否對心肌肥大具有一定的調(diào)控作用，對于進一步闡明心肌肥大的分子機制具有重要的意義。

材 料 和 方 法

1 材料

單克隆兔抗p-AMPKα和AMPKα購于Cell Signaling Technology；單克隆鼠抗PPARα、單克隆兔抗SCAD、單克隆鼠抗α-tubulin、非諾貝特、5-bromo-2’-deoxyuridine(BrdU)、PE和5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸(5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonu-cleotide,AICAR)購于Sigma；BCA蛋白定量試劑盒和Western blotting發(fā)光液購于Thermo；游離脂肪酸含量測定試劑盒購于南京建成；RT-PCR測定試劑盒和TRIzol購于TaKaRa。

2 方法

2.1乳鼠心肌細胞培養(yǎng) 采用乳鼠心肌細胞改良法分離并培養(yǎng)心肌細胞，取2～3 d SD乳鼠(廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心)心臟用0.8%胰蛋白酶(Sigma)冰上消化20 min后，37 ℃水浴4 min，1次消化將乳鼠心臟消化成為單細胞懸液，在差速貼壁分離1 h后，調(diào)節(jié)細胞密度接種于培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并加入BrdU (0.1 mmol/L)抑制成纖維細胞生長48 h。無血清培養(yǎng)24 h后，心肌細胞預先給予非諾貝特(10 μmol/L)或AICAR (0.5 mmol/L)30 min，再加入PE(20 μmol/L)刺激心肌細胞24 h，建立心肌細胞肥大模型。

2.2SCADRNA干擾SCADsiRNA購于上海吉瑪生物制藥技術(shù)有限公司，序列見表1。采用35 mm皿，siRNA∶Lipofectamine 2000 為 20 pmol∶1 μL。實驗分組如下： (1) 空白對照組(control,Con)： 不加任何轉(zhuǎn)染試劑，不加siRNA；(2) 陰性對照組(negative control,NC)： 加轉(zhuǎn)染試劑和陰性對照siRNA；(3) siRNA-1186轉(zhuǎn)染組：加轉(zhuǎn)染試劑和siRNA-1186；(4) siRNA-744轉(zhuǎn)染組：加轉(zhuǎn)染試劑和siRNA-744；(5) siRNA-207轉(zhuǎn)染組：加轉(zhuǎn)染試劑和siRNA-207。轉(zhuǎn)染方法按照公司提供的轉(zhuǎn)染試劑說明書進行。

表1 siRNA 序列

2.3SCAD活性測定 按上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司提供的說明書進行實驗，心肌細胞以(1～5)×106細胞密度接種于60 mm皿中，細胞生長密度達到70%～80%時以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)16～24 h 后，更換新的無血清培養(yǎng)基并且加入處理因素。

古樹名木是一種自然資源，也是一種文化遺產(chǎn)，具有重要的經(jīng)濟、生態(tài)、科研、歷史、紀念等價值。古樹名木作為森林資源，可涵養(yǎng)水源、保持水土、除塵抑菌，具有穩(wěn)固的生態(tài)功能[4]；是珍貴的活文物，與城鎮(zhèn)和宗教文化發(fā)展息息相關(guān)，具有深刻的歷史文化價值[5]；是自然科學研究的活標本，具有重要的科學價值[6]；具有獨特的觀賞價值，是自然景觀和文化景觀的結(jié)合，是絕佳的旅游資源[7]。對古樹名木的現(xiàn)狀進行調(diào)查分析，并探討相應的保護策略具有重大理論和現(xiàn)實意義。

2.4心肌細胞表面積測定 PE刺激24 h后，用Zeiss(AX10)倒置熒光顯微鏡(×200)進行拍照，各處理組隨機選取10個視野，測量100個細胞的表面積，重復3次以上實驗，用ImageJ圖像分析系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析。

2.5心肌細胞游離脂肪酸的含量測定 PE刺激24 h后，提取心肌細胞的總蛋白，采用BCA試劑盒進行蛋白定量，按照試劑盒說明書進行游離脂肪酸濃度的測定，根據(jù)吸光率計算心肌細胞中游離脂肪酸的含量。

2.6Real-time PCR檢測PPARα、SCAD、心房利鈉因子(atrial natriuretic factor，ANF)和腦利鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP) mRNA的表達 按照TRIzol說明書步驟提取細胞總RNA，采用紫外分光光度計檢測RNA樣品的A260/A280比值在1.8～2.0之間，以確定RNA純度，并計算出RNA的濃度。參照RT-PCR試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應，將反應管放置于PCR儀中進行逆轉(zhuǎn)錄反應，逆轉(zhuǎn)錄反應參數(shù)：95 ℃ 30 s (1個循環(huán))， 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s(40個循環(huán))。

RT-PCR擴增的引物序列見表2。兩步法進行PCR擴增反應，按照說明書加入SYBR熒光染料、引物序列(上海生工生物工程股份有限公司)和RT產(chǎn)物后在real-time PCR儀中進行反應。反應參數(shù)如下：95 ℃ 10 s，90 ℃ 5 s，循環(huán)50次；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 h，65 ℃ 30 s，循環(huán)61次。每組樣品設置3個復孔，以保證實驗結(jié)果的有效性和重復性。

表2 RT-PCR擴增的引物序列

2.7Western blotting檢測p-AMPKα、PPARα和SCAD蛋白的表達 提取各組心肌細胞總蛋白，BCA試劑盒檢測細胞蛋白含量后調(diào)整上樣量，分裝、變性，配置10% SDS分離膠和5%濃縮膠進行電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫封閉2 h后加入Ⅰ抗(SCAD為1∶1 000; PPARα為1∶500; p-AMPKα為1∶1 000; AMPKα為1∶1 000；α-tubulin為1∶5 000)，過夜。漂洗后加入Ⅱ抗，室溫孵育1 h，化學發(fā)光試劑增強反應，X光壓片曝光、顯影、定影，結(jié)果采用ImageJ圖像分析系統(tǒng)對條帶進行分析。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)均以數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件處理，組間比較應用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 siRNA的篩選結(jié)果

采用Western blotting、RT-PCR和SCAD活性測定比較3條干擾序列對SCAD的干擾效果，從圖1可見，與空白對照和陰性對照組相比較，siRNA-1186、siRNA-744和siRNA-207均可以不同的程度降低SCAD蛋白、mRNA表達和酶活性，其中以siRNA-1186在蛋白、mRNA和酶活性水平上的降低程度最明顯。因此選擇siRNA-1186進行后續(xù)實驗。

Figure 1. Selection of the siRNA sequences in cardiomyocytes.A: Western blotting results;B: RT-PCR results;C: SCAD activity.Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01 vs Con.

2 siRNA-1186敲低SCAD基因?qū)π募〖毎砻娣e及脂質(zhì)代謝的影響

由圖2可見，siRNA-1186通過瞬時轉(zhuǎn)染對SCAD基因表達進行干擾后，心肌細胞表面積明顯增加，心肌細胞出現(xiàn)了明顯肥大，其程度與刺激因素PE誘導的心肌肥大趨勢一致。此外，心肌細胞對脂肪酸的氧化能力明顯降低，心肌細胞內(nèi)游離脂肪酸含量顯著增多，SCAD下調(diào)對心肌細胞脂質(zhì)代謝的影響與PE誘導心肌細胞肥大導致的脂質(zhì)變化一致。這表明SCAD的表達下調(diào)可能導致了心肌細胞脂肪酸β氧化能力下降，從而引起心肌細胞的游離脂肪酸含量增加，導致心肌細胞肥大發(fā)生。

3 siRNA-1186敲低SCAD基因?qū)π募〖毎康幕虮磉_與SCAD酶活性的影響

由圖3可見，siRNA-1186敲低SCAD基因和PE刺激均引起SCAD mRNA、蛋白表達及酶活性水平顯著下降。此外，心肌肥厚標志因子ANF和BNP mRNA表達均有明顯的上升，表明二者均引起心肌細胞出現(xiàn)了明顯肥大，SCAD在心肌肥大過程中具有重要作用，其表達量的降低可能是造成心肌肥大的一個重要因素。

4 非諾貝特對1186敲低SCAD基因的心肌細胞保護作用

從圖4可以看出，siRNA-1186通過瞬時轉(zhuǎn)染對SCAD基因表達進行干擾后，SCAD mRNA、蛋白及酶活性均明顯降低，心肌細胞表面積明顯增加，心肌肥厚標志因子ANF和BNP mRNA表達明顯上升，心肌細胞內(nèi)游離脂肪酸含量明顯增加。與siRNA-1186干擾SCAD后的心肌細胞相比，非諾貝特預處理作用于敲低SCAD的心肌細胞后，心肌細胞表面積明顯變小，細胞內(nèi)游離脂肪酸含量顯著減少,肥厚標志因子ANF和BNP mRNA表達有明顯的下降，SCAD mRNA水平明顯升高，相對應的蛋白表達量及SCAD酶活性也顯著增高,見圖4、5。這表明心肌肥大過程中PPARα對SCAD有直接的調(diào)控作用。

Figure 2. The changes of surface area (A,B) and content of free fatty acids (C) in the cardiomyocytes treated with phenylephrine (PE, 20 μmol/L) or siRNA-1186.Mean±SD.n=5. **P<0.01 vs Con.

Figure 3. The expression and activity of SCAD in cardiomyocytes treated with phenylephrine (PE, 20 μmol/L) or siRNA-1186. A: Western blotting results; B: RT-PCR results; C: SCAD activity.Mean±SD.n=5.##P<0.01 vs NC;**P<0.01 vs Con.

Figure 4. The effect of fenofibrate (Feno) on the surface area (A) and content of free fatty acids (B) in the cardiomyocytes treated with siRNA-1186.Mean±SD.n=5. **P<0.01 vs Con; #P<0.05, ##P<0.01 vs siRNA-1186.

Figure 5. The effect of fenofibrate (Feno) on the expression and the activity of SCAD in cardiomyocytes treated with siRNA-1186. A: Western blotting results; B: RT-PCR results; C: SCAD activity.Mean±SD.n=5.**P<0.01 vs Con; #P<0.05, ##P<0.01 vs riRNA-1186.

5 非諾貝特對PE處理的心肌細胞表面積及游離脂肪酸含量的影響

圖6顯示，PE刺激24 h后，心肌細胞表面積明顯增大，出現(xiàn)了心肌細胞肥大，而用非諾貝特能明顯預防心肌細胞肥大，心肌細胞表面積明顯減少。心肌細胞內(nèi)的游離脂肪酸含量明顯增多，而非諾貝特能顯著降低心肌細胞的游離脂肪酸含量。

Figure 6. The effect of fenofibrate (Feno) on the surface area (A) and content of free fatty acids (B) in cardiomyocyte treated with phenylephrine (PE). Mean±SD.n=5.**P<0.01 vs Con; #P<0.05 vs PE.

6 非諾貝特對PE處理的心肌細胞PPARα和SCAD蛋白及mRNA表達的影響

由圖7可見，PE刺激24 h后，心肌細胞內(nèi)肥大標志物ANF和BNP mRNA表達量均顯著上升，說明心肌細胞肥大模型建立成功。而SCAD和PPARα蛋白及mRNA表達水平均顯著下調(diào)，表明心肌細胞肥大模型中，SCAD的表達下調(diào)，可能導致了心肌細胞的脂肪酸β氧化能力下降，從而引起心肌細胞的游離脂肪酸含量增加。非諾貝特能使PPARα和SCAD蛋白及mRNA水平顯著上調(diào)，表明非諾貝特可能通過增加SCAD的表達，從而導致心肌細胞脂肪酸β氧化能力增強，引起心肌細胞的游離脂肪酸含量下降，預防心肌細胞肥大。

Figure 7. The effect of fenofibrate (Feno) on the expression of PPARα and SCAD at mRNA and protein levels in the cardiomyocytes treated with phenylephrine (PE).A: Western blotting results; B: RT-PCR results; C: SCAD activity.Mean±SD.n=5. **P<0.01 vs Con; #P<0.05，##P<0.01 vs PE.

7 AICAR對PE處理的心肌細胞表面積及游離脂肪酸含量的影響

由圖8可見，PE刺激24 h后，心肌細胞表面積明顯增大，而AICAR能顯著逆轉(zhuǎn)心肌細胞肥大；心肌細胞內(nèi)的游離脂肪酸含量明顯增多，而AICAR能顯著降低心肌細胞的游離脂肪酸含量，這一變化趨勢與非諾貝特預處理相一致。

Figure 8. The effect of 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide (AICAR) on the surface area (A) and content of free fatty acids (B) in the cardiomyocytes treated with phenylephrine (PE).Mean±SD.n=5. **P<0.01 vs Con; #P<0.05 vs PE.

8 AICAR對PE處理的心肌細胞p-AMPKα、PPARα及SCAD表達的影響

由圖9可見，PE刺激24 h后，心肌細胞ANF和BNP mRNA表達量均顯著上升，而SCAD和PPARα mRNA表達則有所下調(diào)。與mRNA的變化趨勢一致的是，PE刺激24 h后，SCAD、PPARα和p-AMPKα蛋白水平亦顯著下調(diào)。AICAR能顯著激活AMPK，使p-AMPKα表達下調(diào)。同時， PPARα和SCAD蛋白和mRNA水平均顯著上調(diào)，表明AICAR可能通過激活AMPK增加PPARα的表達，從而上調(diào)下游基因SCAD，導致心肌細胞的脂肪酸β氧化能力增強，引起心肌細胞的游離脂肪酸含量下降，預防心肌細胞肥大。

Figure 9. The effect of 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide (AICAR) on the protein and mRNA expression of p-AMPKα, PPARα and SCAD in the cardiomyocytes treated with phenylephrine (PE).A: Western blotting results; B: RT-PCR results; C: SCAD activity. Mean±SD.n=5.**P<0.01 vs Con; #P<0.05,##P<0.01 vs PE.

討 論

心肌肥大是心肌細胞對高血壓、瓣膜病、急性心肌梗死及先天性心臟病等常見臨床疾病的一種基本應答。心肌肥大的病理轉(zhuǎn)變過程可分為肥大進展、肥大代償和肥大失代償期3個階段。引起心肌肥大的發(fā)生機制極其復雜，至今仍未完全明了[10]。

心肌肥大是肥大刺激誘導核內(nèi)基因異常表達的結(jié)果，細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路是肥大刺激與核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄活化的偶聯(lián)環(huán)節(jié)。然而，不同刺激誘導的心肌肥大可能具有不同的“分子表型”，這主要取決于它們啟動的信號轉(zhuǎn)導通路。對心肌肥大信號轉(zhuǎn)導通路的深入認識，不僅有助于闡明心肌肥大的分子機制，而且可為藥物干預防治心肌肥大提供新思路[11]。

研究證實，胚胎時期哺乳動物心肌處于相對缺氧的環(huán)境，以葡萄糖及丙酮酸作為主要的能源物質(zhì)，出生后則轉(zhuǎn)為依賴脂肪酸氧化[12]。大量證據(jù)表明：當病理因素導致心肌肥大時，心肌能源供給由脂肪酸β氧化轉(zhuǎn)變?yōu)橐云咸烟堑慕徒鉃橹?，即心肌能量代謝的“胚胎型再演”[13]。而與脂肪酸β氧化密切相關(guān)的SCAD是高度保守的?；o酶A脫氫酶家族成員之一，是脂肪酸β氧化第一步反應的限速酶。SCAD蛋白表達隨年齡變化逐漸增加，且血清和心肌游離脂肪酸含量逐漸減少，可能與大鼠心肌對能量代謝底物的利用轉(zhuǎn)變有關(guān)[2]。因此，SCAD作為脂肪酸β氧化的關(guān)鍵酶，其表達變化與心臟生長發(fā)育密切相關(guān)的同時，對心臟的能量代謝也起到重要的作用，進一步研究SCAD在心肌肥大能量代謝中的機制有著重要的意義。

本研究進一步采用RNA干擾技術(shù)敲低SCAD的表達，觀察SCAD與心肌細胞肥大的關(guān)系，并與PE誘導的心肌細胞肥大模型相比較。我們觀察到，敲低SCAD的表達后，心肌細胞表面積明顯增大，心肌肥大標志因子ANF和BNP mRNA水平均顯著上升，與PE誘導的心肌肥大趨勢一致，SCAD的表達下調(diào)直接導致了心肌細胞的肥大發(fā)生，表明SCAD在心肌肥大的發(fā)生中具有重要作用。

敲低SCAD的表達后，心肌細胞內(nèi)SCAD的蛋白表達和酶活性明顯降低，心肌細胞內(nèi)游離脂肪酸含量顯著升高，提示心肌細胞的能量代謝出現(xiàn)了明顯改變。SCAD下調(diào)對心肌細胞脂質(zhì)代謝的影響與PE誘導心肌細胞肥大導致的脂質(zhì)變化一致。此外，PE誘導的心肌肥大模型中，SCAD mRNA、蛋白表達及酶活性均顯著下降。因此，我們推測，SCAD的脂肪酸氧化作用顯著下降，可能導致了心肌細胞對脂肪酸的攝取和氧化能力明顯降低，從而引起心肌細胞游離脂肪酸含量不斷增多。

PPARα是核受體超家族成員，主要分布在脂肪酸氧化效率高的組織，是生理條件下心肌脂質(zhì)和能量代謝的重要調(diào)控因子。然而，包括SCAD在內(nèi)，依賴PPARα的脂肪酸代謝酶至少有7個。因此，心肌中高分布的PPARα與心肌能量代謝密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)PE刺激24 h后，心肌細胞明顯肥大，心肌細胞的游離脂肪酸含量明顯增加，并伴有PPARα和SCAD的表達下調(diào)，呈現(xiàn)脂肪酸的利用減少和SCAD的表達下調(diào)相一致的趨勢，表明肥大心肌存在脂肪酸氧化酶基因表達水平的降低，從而引起脂肪酸利用受阻，最終導致心肌能量代謝障礙，可能與肥大心肌細胞中PPARα的表達水平降低，引起的SCAD表達減少有關(guān)。本研究采用PPARα受體激動劑，觀察到非諾貝特在激活PPARα和SCAD表達的同時，可明顯逆轉(zhuǎn)心肌細胞肥大，增強肥大心肌細胞對脂肪酸的代謝，降低心肌細胞中游離脂肪酸的含量。并在證實SCAD下調(diào)與心肌肥大脂質(zhì)代謝密切相關(guān)的基礎上，觀察到非諾貝特預處理可以上調(diào)SCAD mRNA、蛋白表達及增高酶的活性，減少心肌細胞表面積，降低肥厚標志因子ANF和BNP mRNA表達，減低心肌細胞內(nèi)游離脂肪酸的含量，直接預防敲低SCAD引起的心肌細胞肥大，表明心肌肥大中PPARα對SCAD具有直接的調(diào)控作用。綜上所述，非諾貝特可能通過激活心肌細胞PPARα，進而上調(diào)依賴PPARα的下游基因SCAD，使SCAD酶活性增強，從而增強心肌細胞脂肪酸的β氧化，改善心肌細胞的能量代謝，預防心肌細胞肥大。這表明PPARα/SCAD信號途徑對心肌肥大具有直接的調(diào)控作用。

AMPK是一個表達在心血管系統(tǒng)的異源三聚體蛋白，能調(diào)節(jié)體內(nèi)能量代謝，在壓力超負荷的作用下，會增加細胞AMP/ATP的比率，導致ATP減少。AMPK失活與心肌功能障礙及其它代謝性疾病相關(guān)[14]， AICAR為AMPK的激活劑，可通過激活AMPKα磷酸化位點Thr172，對PE誘導的心肌肥大有一定的保護作用[15]。本研究顯示，PE刺激24 h后，p-AMPK的表達顯著下調(diào)，AICAR在激活AMPK的同時，可明顯逆轉(zhuǎn)心肌細胞肥大，顯著增強肥大心肌細胞的脂肪酸氧化，并伴隨著PPARα及SCAD的表達上調(diào)，表明AICAR可能通過激活AMPK進而活化PPARα，上調(diào)脂肪酸氧化限速酶SCAD的表達，從而增強心肌細胞脂肪酸的β氧化，改善能量代謝，預防心肌細胞肥大。可見，AMPK/PPARα/SCAD信號途徑可能介導了心肌細胞肥大的發(fā)生。

研究表明，體外激活AMPK抑制心肌肥大是通過FOXO1/MuRF1信號通路介導的[16]。而AICAR可通過激活ERK1/2信號途徑，從而提高PPARα活性，抑制心肌肥大[9]?？梢姡せ預MPK/PPARα信號通路可能與AMPK/FOXO1/MuRF1信號通路有關(guān)，ERK1/2信號途徑是否參與了AMPK/PPARα/SCAD信號通路對心肌肥大的調(diào)控，有待進一步研究。

[參 考 文 獻]

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