卡維地洛抑制大鼠起搏心肌細胞鈣庫超載誘導(dǎo)的鈣釋放*

趙瑞富， 李成鵬， 婁蓉蓉， 張存泰， 解翠紅， 王 琳， 馬業(yè)新， 周 強△

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院 1心內(nèi)科， 2綜合科， 3急診內(nèi)科，湖北 武漢 430030)

卡維地洛是具有α1、β受體阻滯及抗氧化等多重作用的第3代β受體阻滯劑。大量臨床研究顯示[1-3]，卡維地洛對多種原因引起的心律失常尤其是各種室早、室速等具有明顯的抑制作用。既往研究認為其機制可能與其α1、β受體阻斷作用，以及抗氧化作用和L型鈣通道的阻滯作用等有關(guān)[4-5]。最新研究顯示[6]，卡維地洛可直接結(jié)合心肌細胞肌漿網(wǎng)蘭尼堿受體2(ryanodine receptor 2, RyR2),顯著縮短通道的單次開放時間從而抑制鈣波的形成。RyR2是心肌細胞電機械偶聯(lián)的重要調(diào)控因子，RyR2功能障礙造成Ca2+滲漏是心力衰竭和致死性心律失常的重要原因之一[7-8]。當(dāng)肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+過度超載激活RyR2舒張期開放誘發(fā)自發(fā)性鈣釋放，表現(xiàn)為由細胞一端傳導(dǎo)至另一端的鈣波，具有明顯的致心律失常性[9]。我們用鈣庫超載誘導(dǎo)的鈣釋放(store overload-induced calcium release, SOICR)來命名這樣的自發(fā)性鈣釋放事件。SOICR不同于鈣誘導(dǎo)的鈣釋放(calcium-induced Ca2+release, CICR)，后者是經(jīng)L型鈣通道內(nèi)流的小量鈣誘發(fā)RyR2收縮期開放致大量鈣自鈣庫流出，形成細胞收縮的基礎(chǔ)。在前期研究中，我們對靜止的心肌細胞利用高鈣溶液灌流誘導(dǎo)SOICR，而卡維地洛可以明顯抑制這種自發(fā)性鈣釋放[6]。但是這種SOICR模型不是生理性的，其細胞的鈣操縱方式與規(guī)律跳動的心肌細胞完全不同。生理狀態(tài)收縮/舒張的心肌細胞鈣負載主要是通過L型鈣通道，鈣操縱的方式主要是電機械偶聯(lián)。再者，卡維地洛對于RyR2通道的門控調(diào)節(jié)除了能阻滯SOICR以外尚需關(guān)注同時對CICR的不利影響。因此本研究的目的，一是探索建立一個接近生理狀態(tài)的心肌細胞SOICR模型，二是在這個細胞模型上研究非選擇性β受體阻滯劑卡維地洛對SOICR和CICR的作用及其可能作用機制。

材 料 和 方 法

1 大鼠單個心肌細胞的制備

成年健康SD大鼠，雌雄不拘，體重200～250 g，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。大鼠腹腔注射烏來糖充分麻醉后，開胸取心臟，懸掛于Langendorff裝置行主動脈逆行灌流，酶解液循環(huán)灌流8～10 min直至心臟變?nèi)彳洸⑺沙?，將心室剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小的心肌塊置于酶解液中輕柔吹打分散，鏡下觀察呈單個靜止桿狀心肌細胞即可，過濾后1 000 r/min離心1 min，棄去上清液，將心肌細胞依次加入50、100、250、500 μmol/L及1 mmol/L的復(fù)鈣液中各10 min進行逐步復(fù)鈣，靜置1 h后即可進行實驗。

2 溶液與試劑

卡維地洛、2,3-butanedione monexime和蛋白酶(protease)均購自Sigma；試劑 F-127和Ⅱ型膠原酶(collagenase Ⅱ)購于Worthington；Fluo-4購于Introvengen；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。 KRH液(mmol/L)：NaCl 125、KCl 5.0、MgCl21.2、HEPES 15、glucose 11，用NaOH滴定pH至7.37；灌流液：將taurine 1.8 mL(0.5 mol/L)和BDM 2.25 mL (0.5 mol/L)加入150 mL KRH液中；酶解液：取上述灌流液30 mL加入30 mg collagenase和4 mg protease及7.5 μL CaCl2(0.1 mol/L)；復(fù)鈣液：將BSA 250 mg加入60 mL灌流液中，配制50 μmol/L、100 μmol/L、250 μmol/L和500 μmol/L的復(fù)鈣液各10 mL及1 mmol/L的復(fù)鈣液20 mL。

3 實驗分組

實驗分為空白對照(DMSO)組、α受體阻滯劑酚妥拉明(0.2 μmol/L)組β受體阻滯劑美托洛爾(0.2 μmol/L)組、L型鈣通道阻滯劑硝苯地平(0.2 μmol/L)組和卡維地洛(0.1 μmol/L)組。

4 胞內(nèi)鈣實時測定及SOICR的誘發(fā)實驗

鈣離子探針配制：將Fluo-4用DMSO配制成母液(5 mmol/L)，加入含1 mmol/L鈣的KRH液稀釋至5 μmol/L，同時加入F-127(終濃度為0.02%)。取適量細胞與Fluo-4孵育20 min以載入鈣染料。應(yīng)用倒置熒光顯微鏡(Nikon Ti-S)及Simple PCI軟件記錄細胞內(nèi)熒光強度，激發(fā)波長495 nm，發(fā)射波長518 nm，CCD以10幀/秒速度記錄Ca2+圖像，輸入計算機系統(tǒng)，經(jīng)軟件處理得到清晰的圖像，并可進行量化分析換算出某一選定區(qū)域內(nèi)Ca2+熒光強度隨時間變化的曲線。將心肌細胞放置到帶有起搏電極的灌流槽中，整個過程用含實驗藥物及1 mmol/L Ca2+的KRH液灌流。刺激程序：以1.5倍閾電壓場刺激起搏心肌細胞，起搏頻率1、2、3和4 Hz依次各刺激15次，頻率增加時間歇10 s；換用含0.1 mmol/L異丙腎上腺素和0.3 μmol/L咖啡因的灌流液持續(xù)灌流5 min同時以0.3 Hz的基礎(chǔ)刺激頻率起搏；隨后重復(fù)1～4 Hz的起搏程序，2次起搏之間以及起搏停止后出現(xiàn)的自發(fā)性鈣釋放認定為SOICR。最后局部快速給予高濃度咖啡因(20 mmol/L)灌流，致肌漿網(wǎng)中Ca2+全部釋放至胞漿中，得到咖啡因峰值用于估測鈣庫的總鈣量。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析，計數(shù)資料以百分率表示，采用卡方檢驗，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較時采用單因素方差分析(ANOVA)，兩兩對比時采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 起搏心肌細胞SOICR模型的建立

對照組基線刺激時，1～4 Hz頻率心肌細胞SOICR發(fā)生率(包括起搏間及起搏停止后的自發(fā)性鈣釋放)分別為0%、2.56%、5.13%和10.26%，隨后以0.1 mmol/L異丙腎上腺素和0.3 μmol/L咖啡因灌流同時以0.3 Hz起搏心肌細胞5 min后重復(fù)上述起搏刺激程序，發(fā)現(xiàn)細胞的SOICR發(fā)生率顯著增高，且隨著刺激頻率的增加而增高(分別為43.59%、74.36%、87.18%和89.74%，與基線刺激對比均P<0.01)；起搏時鈣瞬變振幅較前明顯增高(P<0.01)，細胞呈鈣超載狀態(tài)。兩次起搏之間和(或)起搏停止后出現(xiàn)的自發(fā)性鈣釋放，認定為SOICR，見圖1。

Figure 1. The representative Ca2+ imaging traces under the condition of before (A) and after (B) perfusion with isoprenaline and caffeine were shown. Spontaneous Ca2+ release events after the pacing and between pacing beats were defined as SOICR (B, C). The percentage of the cells with SOICR (D) and amplitude of Ca2+ transient (E) in control group before and after perfusion with isoprenaline and caffeine were shown. Mean±SD.n=39.**P<0.01 vs before Ca2+ overload.

2 卡維地洛及其它干預(yù)處理對起搏心肌細胞SOICR的影響

圖2顯示與對照組相比，卡維地洛(0.1 μmol/L)組細胞在1～4 Hz頻率起搏時SOICR發(fā)生率均顯著降低，分別為2.00%、6.00%、10.00%和16.00%(均P<0.01)；卡維地洛對心肌細胞SOICR的抑制率[1-(卡維地洛組SOICR發(fā)生率-卡維地洛組基線SOICR發(fā)生率)/(對照組SOICR發(fā)生率-對照組基線SOICR發(fā)生率)]在不同起搏頻率下無明顯差異(P>0.05)；酚妥拉明(0.2 μmol/L)、美托洛爾(0.2 μmol/L)和硝苯地平(0.2 μmol/L)處理細胞后均未降低SOICR的發(fā)生率(均P>0.05)，提示卡維地洛可以顯著抑制心肌細胞SOICR的發(fā)生，其作用并不是通過對α、β受體和L型鈣通道的阻滯實現(xiàn)的。

Figure 2. Incidence of SOICR in cardiomyocytes after treated with different drugs and the inhibitory effect of carvedilol. A: the percentage of the cells with SOICR in different groups. Con: control (n=39); Phe: phentolamine (0.2 μmol/L, n=35); Met: metoprolol (0.2 μmol/L, n=34); Nif: nifedipine (0.2 μmol/L, n=41); Car: carvedilol (0.1 μmol/L, n=50). B: the suppression of SOICR with Car at various pacing frequency compared with control. C: representative imaging traces showed spontaneous Ca2+ release event in control group but not in carvedilol group at the pacing frequency from 1 to 4 Hz. Mean±SD.**P<0.01 vs control group.

3 卡維地洛及其它干預(yù)處理對起搏心肌細胞CICR的影響

在1～4 Hz刺激頻率下，卡維地洛、酚妥拉明、美托洛爾、硝苯地平組心肌細胞起搏時鈣瞬變振幅與對照組均無明顯差異(均P>0.05)；快速給予高濃度咖啡因誘導(dǎo)心肌細胞肌漿網(wǎng)鈣庫全部釋放，測得的咖啡因峰值用于估測鈣庫鈣總量，各組間比較均無明顯差異(均P>0.05)。0.1 μmol/L卡維地洛對心肌細胞CICR及肌漿網(wǎng)鈣庫鈣容量無明顯影響，但可以抑制SOICR的發(fā)生，見圖3。

討 論

近年來研究顯示SOICR在兒茶酚胺敏感的多形性室性心動過速(catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia, CPVT)和心力衰竭致死性心律失常的發(fā)生中具有重要作用[6, 8]。SOICR的發(fā)生涉及2個主要環(huán)節(jié)：一是鈣超載，二是RyR2的過度活化開放，特別是自發(fā)性開放的閾值降低時(可由于基因突變或功能位點的過度磷酸化等所致)。阻止SOICR的發(fā)生即是要針對這2個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。心肌細胞發(fā)生鈣超載涉及多種機制和途徑，可通過L型鈣通道、鈉鈣交換、細胞膜通透性增加等引起細胞內(nèi)鈣超載[10]。減少鈣超載可以減少SOICR的發(fā)生，然而心肌在病理狀態(tài)下鈣超載的發(fā)生可能難以避免，因而對RyR2的調(diào)控就成為一個有希望的減少SOICR發(fā)生的治療靶點。

Figure 3. Amplitudes of Ca2+ transient and sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in cardiomyocytes after Ca2+ overload in different groups.A: the amplitudes of Ca2+ transient of cardiomyocytes in different groups at variant pacing frequency were shown; B: sarcoplasmic reticulum Ca2+ content was estimated by the height of Ca2+ transient induced by rapid caffeine (20 mmol/L) application; C: representative Ca2+ oscillations were induced by rapid caffeine (20 mmol/L) application in different groups.Mean±SD. Con,n=39; Phe,n=35; Met,n=34; Nif,n=41; Car,n=50.

起搏心肌細胞SOICR模型的建立不同于靜止心肌細胞的研究體系。在后者模型中，細胞鈣超載通過灌流高濃度鈣液實現(xiàn)，本身不是生理性的，其鈣超載可能與高濃度鈣離子經(jīng)非選擇性陽離子通道內(nèi)流有關(guān)，而且高鈣可能激活鈣敏感受體，通過G蛋白-IP3通路引起SR內(nèi)鈣釋放[11]。在生理性起搏的心肌細胞，鈣超載的實現(xiàn)主要是通過L型鈣通道較多的鈣流入和鈉鈣交換體較少的鈣外流，SR鈣釋放通道RyR2是控制收縮期CICR和舒張期自發(fā)性鈣釋放的關(guān)鍵[12]。本研究通過快頻率電刺激起搏心肌細胞，激活L型鈣通道并灌注異丙腎上腺素及咖啡因誘導(dǎo)鈣庫鈣超載，建立一個接近生理狀態(tài)的心肌細胞SOICR模型。本研究發(fā)現(xiàn)，鈣超載前的基礎(chǔ)刺激心肌細胞SOICR發(fā)生率較低；灌注異丙腎上腺素(激活β1受體誘導(dǎo)鈣超載，主要通過： (1) L型鈣通道磷酸化，Ca2+內(nèi)流增加；(2) 增強肌漿網(wǎng)鈣泵的功能)和咖啡因(活化RyR2致自發(fā)性鈣釋放閾值降低)后，心肌細胞SOICR發(fā)生率顯著增加，且隨起搏頻率增加而增高，呈頻率依賴性，鈣瞬變振幅增大，提示細胞呈鈣超載狀態(tài)。

與既往在靜止心肌細胞研究模型的發(fā)現(xiàn)類似[6]，卡維地洛在起搏心肌細胞中仍然顯示對SOICR具有良好的抑制作用，而酚妥拉明和美托洛爾均未降低SOICR的發(fā)生率，說明卡維地洛能抑制起搏心肌細胞SOICR的發(fā)生，其作用不依賴于其對α、β受體的阻滯作用。已知卡維地洛能部分阻滯L型鈣通道，其效能明顯弱于強力的鈣通道阻滯劑硝苯地平[4]?？ňS地洛對SOICR的抑制作用可能源于其阻滯L型鈣通道，減少了心肌細胞的鈣內(nèi)流，從而減輕了鈣超載的程度。然而，我們的研究發(fā)現(xiàn)，0.1 μmol/L卡維地洛并沒有降低起搏鈣瞬變的振幅，咖啡因峰值與對照組比較也無顯著差異。即使0.2 μmol/L硝苯地平也未顯示對心肌細胞CICR和肌漿網(wǎng)鈣庫鈣容量有明顯影響。這些都說明0.1 μmol/L卡維地洛抑制SOICR的作用與L型鈣通道無關(guān)。我們的研究還顯示卡維地洛對SOICR的抑制作用在不同起搏頻率下并無明顯差異，即沒有頻率依賴性，這也不同于常見的抗心律失常藥物的作用特性。我們前期的研究[6]發(fā)現(xiàn)，卡維地洛可直接結(jié)合RyR2而減少通道單次開放時間。雖然RyR2的開放事件次數(shù)增多，但每次短暫的開放不能形成有效的舒張期自發(fā)性鈣釋放(SOICR)和鈣波。本研究觀察到0.1 μmol/L卡維地洛能明顯抑制SOICR，但對CICR無影響。這說明SOICR和CICR是兩個不同的過程，為我們選擇性干預(yù)提供了機會。臨床研究發(fā)現(xiàn)[1, 5]，與美托洛爾相比，卡維地洛可更顯著降低心衰患者室性心律失常發(fā)生率及死亡率，這可能與其獨特的藥理作用(例如對RyR2通道的調(diào)控)有關(guān)。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)卡維地洛可明顯抑制起搏心肌細胞SOICR的發(fā)生，同時未見對CICR有明顯影響，其作用機制可能是直接抑制RyR2的自發(fā)性開放而非源于對α1、β1受體和L型鈣通道的阻滯。因此，針對RyR2通道的調(diào)控，有望成為惡性心律失常防治的一個潛在的靶點。

[參 考 文 獻]

[1] Ruwald MH, Ruwald ACH, Jons C, et al. Effect of metoprolol versus carvedilol on outcomes in MADIT-CRT (Multicenter Automatic Defibrillator Implantation Trial With Cardiac Resynchronization Therapy) [J]. J Am Coll Cardiol, 2013, 61(14): 1518-1526.

[2] Oflaz MB, Balli S, Kibar AE, et al. Effects of carvedilol therapy on cardiac autonomic control, QT dispersion, and ventricular arrhythmias in children with dilated cardiomyopathy [J]. Med Sci Monit, 2013, 19:66-72.

[3] Senior R, Muller-Beckmann B, Dasgupta P, et al. Effects of carvedilol on ventricular arrhythmias [J]. J Cardiovasc Pharmacol, 1992, 19 (Suppl 1):S117-S121.

[4] Cheng JH, Niwa R, Kamiya K, et al. Carvedilol blocks the repolarizing K+currents and the L-type Ca2+current in rabbit ventricular myocytes [J]. Eur J Pharmacol, 1999, 376(1-2): 189-201.

[5] Poole-Wilson PA, Swedberg K, Cleland JG, et al. Comparison of carvedilol and metoprolol on clinical outcomes in patients with chronic heart failure in the Carvedilol Or Metoprolol European Trial (COMET): randomised controlled trial [J]. Lancet, 2003, 362(9377): 7-13.

[6] Zhou Q, Xiao JM, Jiang DW, et al. Carvedilol and its new analogs suppress arrhythmogenic store overload-induced Ca2+release [J]. Nat Med, 2011, 17(8): 1003-1009.

[7] Tateishi H, Yano M, Mochizuki M, et al. Defective domain-domain interactions within the ryanodine receptor as a critical cause of diastolic Ca2+leak in failing hearts [J]. Cardiovasc Res, 2009, 81(3):536-545.

[8] MacLennan DH, Chen SR. Store overload-induced Ca2+release as a triggering mechanism for CPVT and MH episodes caused by mutations inRYRandCASQgenes [J]. J Physiol, 2009, 587(Pt 13):3113-3115.

[9] Xie LH, Weiss JN. Arrhythmogenic consequences of intracellular calcium waves [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2009, 297(3):H997-H1002.

[10] Vassalle M, Lin CI. Calcium overload and cardiac function [J]. J Biomed Sci, 2004, 11(5):542-565.

[11] 徐長慶, 張偉華. 心血管系統(tǒng)鈣敏感受體的研究進展[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26(2):409-413.

[12] Venetucci LA, Trafford AW, O’Neill SC, et al. The sarcoplasmic reticulum and arrhythmogenic calcium release [J]. Cardiovasc Res, 2008, 77(2):285-292.