曹冬青， 劉小妮， 徐海艷， 陶 然， 黃 鶯， 金惠銘， 王 睿， 盧 寧

(復旦大學基礎醫(yī)學院生理與病理生理學系，上海 200032)

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)作為一種新的氣體信號分子，對心血管系統(tǒng)有著重要的調(diào)節(jié)作用，參與了多種病理生理過程，如降低血壓、減慢心率、抑制血管平滑肌細胞增殖等。但其對高血壓的具體調(diào)節(jié)機制尚不明確。近年研究證實在高血壓和心衰的發(fā)病過程中，中樞活性氧(reactive oxygen species，ROS)介導了血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)的心血管效應。中樞ROS水平升高會導致延髓頭端腹外側(cè)(rostral ventrolateral medulla，RVLM)等區(qū)神經(jīng)元放電頻率增加，最終引起交感興奮，血壓升高[1-3]。ROS是機體氧化應激的主要來源之一，而H2S能夠通過促進抗氧化物質(zhì)谷胱甘肽的生成，降低ROS水平，保護神經(jīng)元[4]。本課題組前期在整體實驗證實：H2S能降低自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)的ROS水平，繼而降低血壓，減慢心率[5]。同時我們在細胞水平上證實：外源性H2S可抑制Ang II引起的延髓神經(jīng)元ROS水平的升高[6]。在此基礎上，本工作旨在通過給予內(nèi)源性H2S生成酶胱硫醚β-合成酶(cystathionine β-synthetase，CBS)的激動劑——丁酸鈉(sodium butyrate，NaBu)[7]，提高神經(jīng)元內(nèi)源性H2S水平，進一步觀察內(nèi)源性H2S對Ang II引起的ROS水平的影響并對可能的作用機制進行探討。

材 料 和 方 法

1 主要試劑與儀器

Ang II、二氫乙啶(dihydroethidium，DHE)和NaBu均購自Sigma；微管相關蛋白2(microtubule-associated protein 2, MAP-2)抗體(小鼠來源和兔來源)購自Abcam；小鼠來源CBS抗體購自Abnova；神經(jīng)元培養(yǎng)基、B27神經(jīng)細胞生長添加劑、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、2.5% 胰蛋白酶和DMEM/F12培養(yǎng)基均購自Gibco；DAPI、FITC標記山羊抗兔IgG (H+L)、Cy3標記山羊抗小鼠IgG (H+L)、蛋白裂解液和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測試劑盒購自碧云天；SYBR Green和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Toyobo；GAPDH引物和CBS引物由上海桑尼生物科技有限公司合成；二氧化碳恒溫細胞培養(yǎng)箱(上海力申科學儀器有限公司)，無菌超凈臺(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)，激光共聚焦系統(tǒng)(Zeiss)，酶標儀(Tecan)等。

2 原代培養(yǎng)及鑒定延髓神經(jīng)元

2.1原代延髓神經(jīng)元的培養(yǎng) 孕14～16 d SD大鼠購于上海斯萊克實驗動物中心，取胎鼠，在解剖顯微鏡下取延髓組織，剪碎，0.125% 胰酶37 ℃ 消化12 min左右，10% FBS終止消化3次，吹打3次，上清移至新的離心管，1 000 r/min 離心8 min，棄上清，加入神經(jīng)元培養(yǎng)基與B27的混合培養(yǎng)液(比例為49∶1)，重懸細胞。用0.4% 臺盼藍對神經(jīng)元進行計數(shù)，稀釋到所需密度，接種到35 mm的培養(yǎng)皿或96孔板，1周換2次液，每次半量換液，培養(yǎng)7 d左右，待神經(jīng)元發(fā)育成熟，進行以下實驗。

2.2原代延髓神經(jīng)元的鑒定 將已培養(yǎng)7 d左右的延髓神經(jīng)元進行鑒定，具體步驟如下：(1)0.01 mol/L PBS 洗3次；(2)4%多聚甲醛固定細胞20 min；(3)0.01 mol/L PBS洗3次；(4)5% FBS 封閉30 min；(5)加Ⅰ抗MAP-2抗體(1∶400)，37 ℃ 1 h，4 ℃ 過夜；(6)0.01 mol/L PBS洗3次；(7)加Ⅱ抗Cy3(1∶200)，37 ℃ 避光1 h；(8)0.01 mol/L PBS洗3次；(9)DAPI染核5 min；(10)0.01 mol/L PBS洗3次；(11)激光共聚焦系統(tǒng)拍照(×200)鑒定。

3 神經(jīng)元胞內(nèi)ROS水平的檢測

本實驗采用DHE熒光探針法檢測延髓神經(jīng)元胞內(nèi)的ROS (主要為超氧陰離子)水平。神經(jīng)元給藥后，加DHE(5 μmol/L)，37 ℃ 孵育30 min，酶標儀檢測熒光強度，激發(fā)波長515 nm，發(fā)射波長585 nm。

4 總SOD活性的測定

延髓神經(jīng)元預先給予Ang II(1 μmol/L)處理后，(1)用細胞裂解液裂解，細胞刮刀收集至1.5 mL離心管中，16 000×g離心10 min；(2)將上清移入新的離心管；(3)采用BCA法測蛋白濃度；(4)按試劑盒說明測定總SOD的活性。

5 CBS與MAP-2的熒光雙標

將延髓神經(jīng)元培養(yǎng)至7 d左右進行以下實驗：(1)0.01 mol/L PBS 洗3次；(2)4% 多聚甲醛固定細胞20 min；(3)0.01 mol/L PBS洗3次；(4)5% FBS 封閉30 min；(5)加MAP-2抗體(1∶400)與CBS抗體(1∶400)的混合液，37 ℃ 1 h，4 ℃ 過夜；(6)0.01 mol/L PBS洗3次；(7)加抗FITC與抗Cy3混合液(均為1∶200)，37 ℃ 避光1 h；(8)0.01 mol/L PBS洗3次；(9)DAPI染核5 min；(10)0.01 mol/L PBS洗3次；(11)激光共聚焦系統(tǒng)拍照(×200)鑒定。

6 Ang II 對CBS 表達的影響

采用real-time PCR觀察Ang II對CBS mRNA表達的影響。GAPDH上游引物 5’-TGACAACTTTGGCATCGTGG- 3’，下游引物5’ -TGCAGGGATGATGTTCTGGG-3’；CBS上游引物5’ -CCCATCCTTGCAAAGCTTGT-3’，下游引物 5’ -TTGGGGTATCAGGCGAGATC-3’。

7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，兩組間比較應用獨立樣本t檢驗，多組間比較應用單因素方差分析(One-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 原代培養(yǎng)神經(jīng)元的鑒定

MAP-2是神經(jīng)元的特異性標志物。由于本課題組原代培養(yǎng)延髓神經(jīng)元的方法較為成熟，所以本實驗僅對神經(jīng)元進行了標記，以觀察所培養(yǎng)細胞是否為神經(jīng)元。如圖1所示，左上紅色為MAP-2標記的神經(jīng)元，左下藍色為DAPI標記的細胞核，右圖為左側(cè)兩圖的疊加,可見原代培養(yǎng)的細胞90%以上為神經(jīng)元，可進行下一步實驗。

Figure 1. Confocal microscopic demonstration of medullary neurons.

2 Ang II引起神經(jīng)元ROS的升高

為明確Ang II是否可升高延髓神經(jīng)元的ROS水平，我們給予Ang II(1 μmol/L)，37 ℃孵育30 min后，DHE熒光法檢測延髓神經(jīng)元ROS水平。結(jié)果顯示，Ang II可顯著升高延髓神經(jīng)元的ROS水平，見圖2。

Figure 2. Ang II increased ROS level in medullary neurons. Bar graphs summarizing ROS level after treatment with or without Ang II (1 μmol/L) for 30 min. Con: control. Mean±SEM. n=6.**P<0.01 vs con.

3 Ang II引起延髓神經(jīng)元ROS升高的機制

3.1Ang II降低神經(jīng)元總SOD的活性 如圖3所示，Ang II顯著抑制神經(jīng)元總SOD的活性，提示Ang II可能通過抑制總SOD的活性，提高神經(jīng)元ROS水平。

Figure 3. Activity of total SOD was inhibited by Ang II in medullary neurons. Neurons were pretreated with vehicle or Ang II (1 μmol/L) for 30 min. Con: control. Mean±SEM. n=3.**P<0.01 vs Con.

3.2CBS在神經(jīng)元中的表達 如圖4所示，綠色為MAP-2標記的神經(jīng)元，紅色為CBS陽性的細胞，藍色為DAPI標記，疊加圖中黃色為MAP-2與CBS共表達的細胞。結(jié)果顯示，約90%原代培養(yǎng)神經(jīng)元胞體均呈現(xiàn)黃色,提示延髓神經(jīng)元是有CBS表達的，并主要表達在胞漿，為內(nèi)源性H2S的研究提供了結(jié)構基礎。

Figure 4. Expression of cystathionine β-synthase (CBS) in the rat medullary neurons.

3.3Ang II 抑制CBS mRNA的表達 如圖5所示，Ang II顯著抑制CBS mRNA的表達，提示Ang II可能通過抑制CBS的表達，阻斷內(nèi)源性H2S產(chǎn)生，升高神經(jīng)元的ROS水平。

Figure 5. Expression of CBS mRNA was inhibited by Ang II in medullary neurons. Neurons were pretreated with vehicle or Ang II (1 μmol/L) for 30 min.Con: control. Mean±SEM. n=3.*P<0.05 vs Con.

4 內(nèi)源性H2S抑制 Ang II引起的神經(jīng)元ROS水平的升高

4.1單獨給予不同濃度NaBu對神經(jīng)元ROS水平的影響 延髓神經(jīng)元單獨給予NaBu (100 μmol/L、250 μmol/L和500 μmol/L)，酶標儀檢測結(jié)果顯示，神經(jīng)元胞內(nèi)的ROS水平?jīng)]有明顯變化，見圖6A，提示NaBu對于延髓神經(jīng)元基礎ROS水平?jīng)]有顯著作用。

4.2NaBu抑制Ang II引起的神經(jīng)元ROS水平的變化 結(jié)果表明，100 μmol/L NaBu對Ang II引起的ROS水平?jīng)]有明顯作用，250 μmol/L及500 μmol/L NaBu 均可顯著抑制Ang II引起的神經(jīng)元ROS水平升高，并且500 μmol/L NaBu作用更明顯，見圖6B，提示NaBu抑制Ang II引起的神經(jīng)元ROS水平的升高存在劑量依賴性。

討 論

H2S作為第三類氣體信號分子，對心血管系統(tǒng)有著重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明：側(cè)腦室注射低濃度的H2S可降低正常大鼠的血壓和心率，注射不同濃度的S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosine methionine，SAM，一種CBS激動劑)引起相同的效應并呈劑量依賴性；而高濃度的H2S則產(chǎn)生升壓效應[8-9]。本課題組研究顯示：向SHR大鼠RVLM區(qū)微量注射外源性H2S(供體NaHS)可降低血壓和心率；注射CBS激動劑SAM，升高內(nèi)源性H2S水平，引起相同的效應[5]，且均引起ROS水平的降低。研究表明，中樞ROS介導了Ang II的心血管效應[2]?；A和臨床研究也證實：血壓升高常伴有氧化應激的增強[10]。

ROS是生物有氧代謝過程中的一種副產(chǎn)品，包括氧離子、過氧化物和含氧自由基等。過高的活性氧水平會對細胞和基因結(jié)構造成損壞。Ang II引起ROS升高的可能機制有哪些呢？中樞ROS的主要來源是NADPH氧化酶。文獻報道，Ang II與AT1受體結(jié)合，可激活相關信號通路提高NADPH氧化酶的活性，升高機體的ROS水平，繼而升高血壓[2, 11]。在兔的側(cè)腦室注射Ang II，可使RVLM區(qū)部分通過升高NADPH氧化酶亞單位p40phox、p47phox、p67phox和gp91phox高表達，活性氧水平升高[12]。前期工作表明，Ang II可提高延髓神經(jīng)元p47phoxmRNA和p67phoxmRNA的表達量[13]。因此本實驗神經(jīng)元給予Ang II，作為高ROS水平的細胞模型，以與整體實驗相呼應。我們首先證實了Ang II可升高延髓神經(jīng)元的ROS水平。

Figure 6. NaBu inhibited ROS level in medullary neurons induced by Ang II with a dose-dependent manner. A: medullary neurons were treated with various concentrations (100, 250 and 500 μmol/L) of NaBu alone for 30 min; B: neurons were treated with vehicle, Ang II, or various concentrations (100, 250 and 500 μmol/L) of NaBu 30 min before Ang II (1 μmol/L) was used. Mean±SEM. n=6.*P<0.05,**P<0.01 vs Con (0 μmol/L Ang II and 0 μmol/L NaBu).

機體內(nèi)ROS的動態(tài)平衡與SOD有著緊密的聯(lián)系。SOD具有特殊的生理活性，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)。現(xiàn)已證實：SOD可對抗與阻斷因氧自由基對細胞造成的損害，并及時修復受損細胞，復原因自由基造成的細胞傷害。SHR大鼠RVLM區(qū)微量注射SOD可降低血壓[10]。因此，ROS的升高也可能與SOD有一定關系。本研究表明，Ang II降低了延髓神經(jīng)元總SOD的活性，至少部分引起了ROS的升高。

我們的整體實驗中，外源性H2S(NaHS)和內(nèi)源性H2S(SAM)可使SHR大鼠的ROS水平降低。前期細胞實驗證實，外源性H2S(NaHS)通過抑制絲裂原激活的蛋白激酶家族中磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2蛋白的表達量，抑制Ang II引起的ROS的升高[6]。那內(nèi)源性H2S是否能抑制Ang II引起的延髓神經(jīng)元ROS的升高呢？

內(nèi)源性H2S主要由2種酶催化生成：一種是磷酸吡多醛5-磷酸依賴性酶，包括CBS和胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase, CSE)。CBS主要在海馬、小腦、腦干和皮層等部位，而CSE主要分布于神經(jīng)系統(tǒng)以外的組織。另一種是3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase),主要分布于腎、心、肝和腦。本課題組和近期的形態(tài)學研究顯示，CBS在SD大鼠的RVLM、下丘腦室旁核等區(qū)有表達[14]?；几哐獕?周的Wistar 大鼠網(wǎng)狀核神經(jīng)元的CBS表達水平顯著降低[15]。RVLM區(qū)是心血管交感活動的基本中樞，是維持心血管中樞緊張性活動的關鍵部位。本課題組前期整體實驗證實，SHR大鼠RVLM區(qū)催化H2S生成的酶CBS的表達水平低于WKY大鼠[5]。本實驗結(jié)果顯示，CBS在延髓神經(jīng)元有表達，為我們對內(nèi)源性H2S的研究提供了結(jié)構基礎。

CBS是中樞H2S的主要來源，Ang II與CBS之間的作用鮮有報道。本研究發(fā)現(xiàn)，Ang II可降低CBS mRNA的表達量，而它對于CBS蛋白水平的作用還有待進一步驗證。然后我們給予CBS激動劑NaBu，升高內(nèi)源性H2S，再給予Ang II觀察延髓神經(jīng)元ROS水平的變化。結(jié)果表明，內(nèi)源性H2S(NaBu)與外源性H2S(NaHS)有相同的效應，均可抑制Ang II引起的延髓神經(jīng)元ROS水平的升高。但其具體機制還需進一步探討。

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