楊 珂 谷京城

AKT、ERK1/2在下咽鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其相關(guān)性*

楊 珂 谷京城△

目的探討AKT和ERK1/2蛋白在下咽鱗狀細(xì)胞癌組織及正常下咽黏膜組織中的表達(dá)。方法采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)60例下咽鱗狀細(xì)胞癌組織（鱗癌組）及15例正常下咽黏膜組織（對(duì)照組）中AKT和ERK1/2的表達(dá)情況，并分析2種蛋白與下咽癌臨床和病理因素的關(guān)系及AKT與ERK1/2的相關(guān)關(guān)系。結(jié)果下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中AKT和ERK1/2的陽(yáng)性表達(dá)率分別為78.3%(47/60)和66.7%(40/60)，明顯高于正常下咽黏膜組織中的13.3%(2/15)和6.7%(1/15)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；組織分化程度越低，臨床分期越晚，AKT和ERK1/2的陽(yáng)性表達(dá)率越高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中AKT和ERK1/2的陽(yáng)性表達(dá)率較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織高（P＜0.05或P＜0.01）。AKT和ERK1/2的表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.400，P＜0.05)。結(jié)論AKT和ERK1/2在下咽鱗狀細(xì)胞癌中均高度表達(dá)，兩者共同促進(jìn)下咽癌發(fā)生、發(fā)展和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。

癌，鱗狀細(xì)胞；下咽；下咽腫瘤；免疫組織化學(xué)；AKT；ERK1/2

下咽鱗狀細(xì)胞癌（IHSCC）是頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤，由于位置較隱蔽，不易早期發(fā)現(xiàn)，易早期出現(xiàn)淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其診斷和治療比較困難，臨床常采用綜合治療，預(yù)后較差。研究IHSCC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移特性，為尋找腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)尤為重要。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，AKT和ERK1/2在腫瘤研究中已引起人們的關(guān)注，但其在IHSCC中的研究較少。本研究通過(guò)比較AKT和ERK1/2在IHSCC組織及癌旁正常組織中的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討兩者在IHSCC的發(fā)生發(fā)展中的作用及其相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院耳鼻喉頭頸外科2006年7月—2012年10月接受手術(shù)治療并經(jīng)病理證實(shí)為IHSCC的病理組織石蠟標(biāo)本60例，為鱗癌組。其中高分化鱗癌24例，中分化鱗癌26例，低分化鱗癌10例。男58例，女2例，年齡43～85歲，平均60歲。根據(jù)2002年AJCC分期標(biāo)準(zhǔn)，T1～T2期11例，T3～T4期49例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例。另取15例癌旁安全切緣外的下咽黏膜標(biāo)本（病理檢查證實(shí)為正常下咽黏膜）作為對(duì)照組。所有標(biāo)本均行HE染色并由兩名有經(jīng)驗(yàn)病理科醫(yī)師閱片，證實(shí)IHSCC診斷。每例選擇有代表性蠟塊行常規(guī)切片。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療等相關(guān)治療。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化試劑及實(shí)驗(yàn)方法 鼠抗人AKT單克隆抗體（1∶200），鼠抗人ERK1/2單克隆抗體（1∶50），二抗使用生物素化羊抗鼠抗體,抗體均購(gòu)自恩晶生物科技有限公司。常規(guī)SP法，烤片2 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，將準(zhǔn)備滴加AKT抗體的切片進(jìn)行檸檬酸微波修復(fù)，準(zhǔn)備滴加ERK1/2抗體的切片進(jìn)行檸檬酸高壓修復(fù)，抗原修復(fù)后用3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，滴加抗體。DAB顯色，流水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片后鏡檢。染色設(shè)陰性對(duì)照（以PBS代替一抗）。

1.2.2 免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞基本不著色為1分，中等著色為2分，強(qiáng)著色為3分。著色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分率為0者，記0分，＜10%為1分，10%～50%為2分，＞50%為3分。將每張切片著色程度得分與著色細(xì)胞百分率得分各自相乘，為陽(yáng)性系數(shù)。0分者為陰性(-)，1～2分為弱陽(yáng)性(+)，3～4分為陽(yáng)性(++)，大于4分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2及校正χ2檢驗(yàn)；兩個(gè)變量相關(guān)性研究采用Spearman相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AKT和ERK1/2在2組中的表達(dá) AKT在鱗癌組中陽(yáng)性表達(dá)率為78.3%(47/60)，高于對(duì)照組的13.3%(2/15，χ2=19.607，P＜0.05)，陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。ERK1/2在鱗癌組中陽(yáng)性表達(dá)率為66.7%(40/60)，高于對(duì)照組的 6.7%(1/15，χ2=15.095，P＜0.01)，陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。組織分化程度越低，臨床分期越晚，AKT和ERK1/2的陽(yáng)性表達(dá)率越高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中AKT和ERK1/2的陽(yáng)性表達(dá)率較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織高（P＜0.05或P＜0.01），見(jiàn)表1。

2.2 AKT和ERK1/2在鱗癌組中表達(dá)的相關(guān)性 AKT和ERK1/2在IHSCC組織中的表達(dá)呈正相關(guān) (rs=0.400，χ2=15.095，P＜0.01)，見(jiàn)表2。

3 討論

AKT是分子質(zhì)量為57 ku的絲/蘇氨酸蛋白激酶，通過(guò)下游的目標(biāo)物質(zhì)促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲[1]。AKT活化的必要條件是蘇氨酸(T308)和絲氨酸(S473)兩個(gè)位點(diǎn)的磷酸化[2]。其磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase9、NF-κB、Forkhead、mTOR、Par-4、P21等，從而介導(dǎo)胰島素、多種生長(zhǎng)因子等誘發(fā)的細(xì)胞生長(zhǎng)，經(jīng)多種途徑激活細(xì)胞，是重要的抗凋亡因子[3]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，AKT的異常活化是在人類惡性腫瘤發(fā)生中最常見(jiàn)的分子事件之一，其表達(dá)水平與腫瘤的復(fù)發(fā)有關(guān)，可作為生物標(biāo)志物[4]。AKT的抑制是癌癥治療策略[5]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AKT在IHSCC組織中高表達(dá)（78.3%），高于癌旁正常下咽黏膜組織中的13.3%，提示AKT在IHSCC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。組織分化程度越低，臨床分期越晚，AKT的陽(yáng)性表達(dá)率越高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中AKT的陽(yáng)性表達(dá)率較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織高，說(shuō)明AKT的活化可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增生、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移。其機(jī)制可能是AKT被激活后抑制GSK3使細(xì)胞周期蛋白D水平增高，幫助細(xì)胞通過(guò)G1、S期檢驗(yàn)點(diǎn)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲[6]。因此，AKT可能是影響IHSCC惡性生物學(xué)行為和預(yù)后的重要因素。

Table 1 The relationship between the expressions of AKT and ERK1/2 protein and clinical and pathological characters in patients表1 病例組AKT和ERK1/2表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 例(%)

Table 2 The correlation between AKT and ERK1/2 in IHSCC表2IHSCC中AKT和ERK1/2表達(dá)的相關(guān)性（例）

ERK1/2是細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶，又稱p44/p42絲裂原活化蛋白激酶，為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要分子。ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是絲裂原活化蛋白激酶（MPAKs）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路家族的一條，參與細(xì)胞內(nèi)激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞外信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)等多種過(guò)程[7]。在惡性腫瘤細(xì)胞中，由于各種機(jī)制導(dǎo)致ERK過(guò)度活化，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制凋亡，促進(jìn)細(xì)胞侵襲，影響細(xì)胞分化[8]。ERK1/2通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期素D1表達(dá)中起重要作用，而細(xì)胞周期素D1是G1/S調(diào)控點(diǎn)的關(guān)鍵因子[9]。ERK1/2失活能夠使細(xì)胞停滯于G1晚期，不能進(jìn)入S期，過(guò)度活化則促進(jìn)細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。本研究結(jié)果表明，ERK1/2在IHSCC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常下咽黏膜組織。組織分化程度越低，臨床分期越晚，ERK1/2的陽(yáng)性表達(dá)率越高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中ERK1/2的陽(yáng)性表達(dá)率較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織高，說(shuō)明在IHSCC的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中，ERK1/2的過(guò)度激活起到了重要的作用。

AKT和ERK1/2的激活均可對(duì)下游的細(xì)胞周期素D產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響細(xì)胞的活力、分化和增殖。本研究結(jié)果表明，AKT和ERK1/2在下咽鱗癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，兩者在腫瘤的生物學(xué)行為中有協(xié)同作用。對(duì)于AKT和ERK1/2活性升高的腫瘤，可采用RNA干擾或基因剔除技術(shù)，降低兩者的表達(dá)，或者開(kāi)發(fā)以AKT和ERK1/2靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物，檢測(cè)兩者在患者血液中的水平以評(píng)估預(yù)后，為發(fā)現(xiàn)、預(yù)防和治療惡性腫瘤提供新的方向和思路。

[1] Pande S,Browne G,Stein G,et al.Oncogenic cooperation between PI3K/Akt signaling and transcription factor Runx2 promotes the invasive properties of metastatic breast cancer cells[J].J Cell Physiol,2013,228(8):1784-1792.

[2] Cicenas J.The potential role of AKT phosphorylation in human cancers[J].Int J Biol Makers,2008,23(1):1-9.

[3] Song G,Ouyang GL,Bao SD.The activation of AKT/PKB signaling pathway and cellsurvival[J].J Cell Mol Med,2005,9(1):59-71.

[4] Kremer CL,Klein RR,Mendelson J,et al.Expression of mTOR signaling pathway makers in prostate cancer progression[J].Prostate,2006,66(11):1203-1212.

[5] Jing H,Zhou X,Dong X.Abrogation of Akt signaling by Isobavachalcone contributes to its[J].Cancer Letters,2010(294):167-177.

[6] Cooper K,Herrington CS,Graham AK,et al.In situ evidence for HPVs16.18.33 intergration in cervical squamous cell cancer in Britain and South Africa[J].J Clin Pathol,2007,44(5):406-409.

[7] Chang LF,Karin M.Mammalian MAP kinas signaling cascades[J].Nature,2001,410:37-40.

[8] 張麗志,瞿全新.ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控[J].醫(yī)學(xué)綜述,2011,17(6):836-838.

[9] Corona G,Deiana M,Incani A,et al.Hydroxytyrosol inhibits the proliferation of human colon adenocarcinoma cells through inhibition of ERK1/2 and CyclinD1[J].Mol Nutr Food Res,2009,53(7):897-903.

（2013-06-04收稿 2013-11-01修回）

（本文編輯 魏杰）

The Expression and Relationship of AKT and ERK1/2 Proteins in Hypopharyngeal Squamous Cell Carcinoma

YANG Ke,GU Jingcheng
Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery,The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University,Liaoning 121001,China

ObjectiveTo investigate the expressions of AKT and ERK1/2 proteins in hypopharyngeal squamous cell carcinoma and normal hypopharyngeal mucosa.MethodsThe expressions of AKT and ERK1/2 proteins were examined by immunohistochemical S-P technique in 60 patients with hypopharyngeal squamous cell carcinoma and 15 cases of normal hypopharyngeal mucosa.The relationship between expressions of AKT and ERK1/2 proteins and clinical pathological feathers was analyzed.ResultsThe positive rates of the expressions of AKT and ERK1/2 were 78.3%(47/60)and 66.7%(40/60)in 60 cases of hypopharyngeal squamous cell carcinoma,which were significantly higher than those in 15 cases of normal hypopharyngeal mucosa[13.3%(2/15)and 6.7%(1/15),P＜0.05].The lower the degree of differentiation,the later the clinical stage,the higher the positive expression rates of AKT and ERK1/2.There were significantly higher expressions of AKT and ERK1/2 in patients with lymph node metastasis than those of patients without lymph node metastasis(P＜0.05 or P＜0.01).There was a positive correlation between expression levels of AKT and ERK1/2(rs=0.400，P＜0.05).ConclusionThere were higher expression levels of AKT and ERK1/2 in hypopharyngeal squamous cell carcinoma.The activation of AKT and ERK1/2 proteins promotes hypopharyngeal occurrence,development and metastasis.

carcinoma,squamous cell;hypopharynx;hypopharyngeal neoplasms;immunohistochemistry;AKT；ERK1/2

R739.63 【

】 A 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.020

*遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2009225010-39）

遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

△通訊作者 E-mail：gjc20062006@126.com