李璐 李婷 李沐 吳炎 齊琳 崔東明 胡薇

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春，130118)

MiRNA-93-5p對VEGF的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及其與梅花鹿茸細(xì)胞增殖的關(guān)系1)

李璐 李婷 李沐 吳炎 齊琳 崔東明 胡薇

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春，130118)

為了探討miRNA-93-5p對梅花鹿血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用及其與鹿茸細(xì)胞生長的關(guān)系，分離了鹿茸頂端軟骨組織細(xì)胞，利用Trizol試劑法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)GenBank已發(fā)表的相關(guān)序列設(shè)計梅花鹿VEGF基因的3′端非編碼區(qū)部分序列(3′UTR)特異引物并進行克隆，構(gòu)建VEGF基因的3′UTR野生型及其突變體序列雙熒光素酶報告基因載體并進行熒光素酶活性檢測。再將人工合成的miRNA-93-5p模擬物轉(zhuǎn)染鹿茸軟骨細(xì)胞，MTT法檢測鹿茸細(xì)胞體外增殖的變化；Western blotting分析VEGF蛋白的表達豐度。結(jié)果表明：成功獲得了鹿茸組織VEGF基因的3′UTR序列，野生型序列長度為356 bp，突變體長度為336 bp。熒光素酶活性檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒組細(xì)胞熒光素酶活性降低，而轉(zhuǎn)染突變體組細(xì)胞熒光素酶活性無明顯變化。MTT法和Western blotting結(jié)果顯示，鹿茸細(xì)胞的體外增殖受到抑制，VEGF蛋白的表達水平下降，且呈時間依賴性。

鹿茸細(xì)胞；miRNA-93-5p；血管內(nèi)皮生長因子；轉(zhuǎn)錄調(diào)控；細(xì)胞增殖

鹿茸是雄鹿頂部未骨化且密生茸毛的幼角，每年周期性的脫落與再生，是哺乳動物中唯一可以完全再生的器官。鹿茸生長速度極快，在快速生長期可達到12.5 mm/d[1-2]。新生的鹿茸中具有極其豐富的血管，隨著鹿茸的生長，血管也迅速延伸，以提供鹿茸生長時所需的營養(yǎng)物質(zhì)[3-4]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種具有高度生物學(xué)活性的功能性糖蛋白，可以使皮膚血管的通透性明顯增加[5]。Kumar等[6]研究發(fā)現(xiàn)VEGF及其受體(VEGFR)能特異地促進細(xì)胞分裂、增殖及遷移，促進血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂，在腫瘤新生血管生成過程中起著至關(guān)重要的作用。Clark等[7]曾報道VEGF及VEGFR在皮膚、間充質(zhì)層細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和初角茸的骨中都有廣泛地表達。MicroRNA(miRNA)是一種廣泛存在的內(nèi)源性非編碼蛋白質(zhì)的單鏈小RNA，可以通過與靶標(biāo)基因mRNA 3′非編碼區(qū)上的靶點結(jié)合，介導(dǎo)mRNA降解或抑制mRNA轉(zhuǎn)錄后水平的表達，從而導(dǎo)致靶標(biāo)蛋白表達量的下降[8-9]。近十年來的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在胚胎發(fā)育及細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等多種生命活動中發(fā)揮著重要作用[10]。Lei等[11]曾報道m(xù)iRNA能特異性識別VEGF靶基因3′非編碼區(qū)序列，抑制靶基因的翻譯，在蛋白表達的過程中起著精細(xì)的調(diào)節(jié)作用。但是，目前關(guān)于鹿miRNA的研究國內(nèi)外報道甚少。因此，本研究從RNA組學(xué)的角度，以鹿茸頂端組織為研究對象，探討miRNA對VEGF基因表達的調(diào)控及其對鹿茸細(xì)胞增殖的影響，以期更深入地探討細(xì)胞生長因子在鹿茸生長調(diào)節(jié)機制方面可能具有的重大意義。此外，還可以促進我國鹿科動物miRNA研究的開展和不斷深入。

1 材料與方法

1.1 材料

供試鹿茸：2013年6月，梅花鹿二杠鋸茸采自長春市農(nóng)科院鹿場一頭3歲左右的東北梅花雄鹿。

主要試劑：限制性內(nèi)切酶HindⅢ與EcoRⅠ購自大連寶生物工程公司；膠原酶Ⅰ、膠原酶Ⅱ、透明質(zhì)酸酶及二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma；高糖DMEM培養(yǎng)基購自Gibco；胎牛血清(FBS)購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；HP轉(zhuǎn)染試劑購自Roche；MTT購自Solarbio；雙熒光素酶報告基因載體、miRNA模擬物購自廣州市銳博生物科技有限公司；Dual-Luciferase Reporter Assay System購自Promega；SYBR GREENⅠ熒光定量PCR試劑盒購自天根生化科技有限公司；Western及IP細(xì)胞裂解液購自碧云天生物技術(shù)公司；兔抗人VEGFA抗體、羊抗兔IgG-HRP購自北京博奧森生物技術(shù)公司；ECL發(fā)光顯色試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 方法

鹿茸軟骨細(xì)胞培養(yǎng)：按照Li等[12]的取材方法，使用高溫消毒處理的手術(shù)刀在離鹿茸頂端5 cm處沿垂直鹿茸生長軸方向切斷。采用酶消化法，將分離出的鹿茸軟骨組織剪成1.0 mm3的小塊，用膠原酶Ⅰ和透明質(zhì)酸酶37 ℃消化1.5 h，再加入膠原酶Ⅱ繼續(xù)消化3 h。當(dāng)觀察到大量細(xì)胞從組織塊中游離出來時，1 000 r·min-1離心5 min。將離心收集的細(xì)胞與組織塊加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中，置于培養(yǎng)箱中37 ℃、5%的CO2繼續(xù)培養(yǎng)。

鹿茸軟骨細(xì)胞總RNA提取與雙鏈cDNA的合成：待鹿茸軟骨細(xì)胞豐度達到80%以上時收集細(xì)胞，按照Trizol操作手冊提取細(xì)胞樣品總RNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。以提取的總RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶AMV作用下反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。

梅花鹿VEGF基因3′非編碼區(qū)(3′UTR)野生型及其突變體序列的克隆與分析：參照GenBank中相關(guān)序列，設(shè)計VEGF基因3′UTR野生型及其突變體序列特異性引物(VEGF 3′UTR-F：CCGCTCGAGAAGGAGCCTCCCTCAGGGTTTCG。VEGF 3′UTR-R：GAATGCGGCCGCTGTGGGTGGGTGTGTCTACAGGAA-TC。VEGF 3′UTR-mut-F：GCGCAGATGTAGCGGGGTCCGG。VEGF 3′UTR-mut-R：GACCCCGCTACATCTGCGCACAG。)。以cDNA為模板進行PCR擴增，利用DNA凝膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α中，涂板并于37 ℃培養(yǎng)。挑取轉(zhuǎn)化菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒并將鑒定正確的重組質(zhì)粒送北京三博遠志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進行序列測序。

雙熒光素酶報告質(zhì)粒的構(gòu)建及熒光素酶活性檢測：將VEGF基因3′UTR野生型及其突變體序列分別連入雙熒光素酶報告基因載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pmiR-PB-ReportTMVector-VEGF-3′UTR，再將重組質(zhì)粒與miR-93-5p模擬物(mimics)共同轉(zhuǎn)染鹿茸軟骨細(xì)胞。培養(yǎng)24、48、72 h后收集6孔培養(yǎng)板中各組細(xì)胞，加入PLB充分裂解，13 000 r·min-1離心5 min，收集上清液。按照Dual-Luciferase Reporter Assay System試劑盒說明書進行操作，再加入LARⅡ溶液，490 nm波長下測定各孔光吸收值，即螢火蟲熒光素酶的活性測定值M1。最后加入Stop&Glo Substrate，490 nm波長下再次測定各孔光吸收值，即海腎熒光素酶活性的測定值M2。熒光素酶的表達量以M1/M2的比值表示。每次3個重復(fù)。

Stem-loop SYBR Green熒光定量PCR檢測：待鹿茸軟骨細(xì)胞匯合度達到80%時，將miR-93-5p模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)24、48、72 h后收集細(xì)胞；提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；以cDNA為模板，PCR分別擴增miR-93-5p及內(nèi)參基因U6。上樣體系，2.5×RealMasterMix 10.0 μL，模板1.00 μL，上游引物1.00 μL，下游引物1.00 μL，20×SYBR Solution 1.25 μL，RNase free H2O補充至25.00 μL。PCR條件，94 ℃ 2 min→(94 ℃ 20 s→58 ℃ 20 s→68 ℃ 20 s)40個循環(huán)，每個樣品重復(fù)3次。數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCt相對定量的方法。

miR-93-5p對鹿茸細(xì)胞體外增殖影響的MTT法檢測：取生長匯合度為80%的鹿茸軟骨細(xì)胞制成細(xì)胞懸液接種于96孔板中，細(xì)胞貼壁后轉(zhuǎn)染miR-93-5p模擬物，培養(yǎng)24、48、72 h后，向培養(yǎng)板中加入5 g·L-1MTT溶液20 μL，37 ℃孵育4 h，棄去上清液。每孔加入200 μL DMSO，酶標(biāo)儀490 nm波長下測定各孔光吸收值(OD值)。

蛋白質(zhì)的免疫印跡分析：將細(xì)胞匯合度為80%的鹿茸軟骨細(xì)胞接種于6孔板中，24 h后轉(zhuǎn)染miR-93-5p模擬物，待培養(yǎng)24、48、72 h后分別收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，12 000 r·min-1離心20 min。BCA法測定蛋白質(zhì)量濃度，并將所有樣品調(diào)至質(zhì)量濃度一致。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)束后，將蛋白膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，TBST洗膜3次，再將PVDF膜置于含一抗兔抗人VEGFA抗體(1∶200)的封閉液中溫浴2 h，TBST洗膜3次，加入羊抗兔的IgG-HRP二抗(1∶500)中，室溫孵育2 h，TBST洗膜后，進行ECL法顯色。

統(tǒng)計學(xué)分析：試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行獨立樣本t檢驗，判斷其統(tǒng)計學(xué)意義，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹿茸組織總RNA提取結(jié)果

采用Trizol法提取鹿茸組織總RNA，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證，提取RNA呈現(xiàn)28、18、5 s 3條帶，總RNA提取成功，可進行后續(xù)試驗(圖1)。

圖1 鹿茸組織總RNA提取電泳圖

2.2 梅花鹿VEGF基因3′UTR野生型及其突變體序列的克隆

以鹿茸軟骨細(xì)胞cDNA為模板，利用VEGF 3′UTR及其突變體引物序列進行PCR擴增，并對重組質(zhì)粒pMD-18T-VEGF 3′UTR(包括野生型及其突變體)進行雙酶切鑒定。PCR及酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果與預(yù)期大小一致，野生型為356 bp，突變型為336 bp(圖2～圖3)。

1.PCR鑒定產(chǎn)物；2.雙酶切產(chǎn)物；M.DNA Marker(DL2000)。

圖2 VEGF基因3′UTR野生型序列PCR擴增結(jié)果及雙酶切鑒定結(jié)果

2.3 熒光素酶活性檢測

熒光素酶活性檢測結(jié)果見表1。與陰性對照組比較，轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性下降，其中48 h最為明顯，證明該轉(zhuǎn)染體系穩(wěn)定有效。將VEGF 3′UTR上預(yù)測的結(jié)合位點突變后，與陰性對照組比較，熒光素酶活性未產(chǎn)生明顯地變化，證實預(yù)測的VEGF 3′UTR上具miR-93-5p的結(jié)合位點。

1.PCR鑒定產(chǎn)物；2.雙酶切產(chǎn)物；M.DNA Marker(DL2000)。

圖3VEGF基因3′UTR突變體序列PCR擴增結(jié)果及雙酶切鑒定結(jié)果

表1 熒光素酶檢測結(jié)果

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2.4 Stem-loop熒光定量PCR檢測miR-93-5p的表達水平

鹿茸軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-93-5p模擬物24、48、72 h后，miR-93-5p相對表達水平分別為296.45、683.74、157.39。與正常細(xì)胞組(10.93)、陰性對照組(8.89)相比，轉(zhuǎn)染組表達水平明顯升高，且48 h表達水平最高，進一步驗證了miR-93-5p可以在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定而高效地表達。

2.5 鹿茸軟骨細(xì)胞體外增殖MTT法檢測

利用MTT法對轉(zhuǎn)染后鹿茸軟骨細(xì)胞的生長狀態(tài)進行觀察。由表2可知，鹿茸軟骨細(xì)胞的增殖在轉(zhuǎn)染miR-93-5p后發(fā)生顯著變化，與正常細(xì)胞組及陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-93-5p組鹿茸軟骨細(xì)胞的增殖速度變緩，體外細(xì)胞的增殖受到抑制。

表2 轉(zhuǎn)染miR-93-5p對鹿茸軟骨細(xì)胞增殖的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2.6 miR-93-5p轉(zhuǎn)染鹿茸軟骨細(xì)胞后VEGF表達的Western blotting檢測

利用Western blotting檢測轉(zhuǎn)染miR-93-5p后鹿茸軟骨細(xì)胞VEGF蛋白的表達水平。結(jié)果顯示，與內(nèi)參GAPDH相比，正常細(xì)胞組與陰性對照組無明顯變化，轉(zhuǎn)染組蛋白表達水平隨著時間的延長逐漸降低，說明miR-93-5p在一定程度上抑制了VEGF蛋白的表達，見圖4。

1.正常細(xì)胞；2.陰性對照；3.轉(zhuǎn)染24 h；4.轉(zhuǎn)染48 h；5.轉(zhuǎn)染72 h。

圖4 轉(zhuǎn)染miR-93-5p后鹿茸軟骨細(xì)胞VEGF蛋白表達的Western blotting檢測

3 結(jié)論與討論

鹿茸是我國名貴的傳統(tǒng)中藥，其藥用價值多少年來一直受到人們的青睞。鹿茸擁有令人驚奇的生物學(xué)現(xiàn)象：其具有驚人的生長速度，但卻沒有任何癌變的跡象；鹿茸是唯一能夠完全再生的哺乳動物器官，每年能夠完全再生一次[13]。因此，鹿茸已經(jīng)成為很好地研究再生的醫(yī)學(xué)模型，為人類提供了唯一的探討生長調(diào)控過程的機會。有研究表明，這一現(xiàn)象是生長中的鹿茸頂端存在血管化的軟骨，而有別于其它典型的無血管化軟骨。但血管在軟骨生長中的機制以及促使鹿茸快速生長的因素至今為止仍不太為人所知。還有研究顯示，在鹿茸頂端前軟骨和軟骨組織檢測到VEGF及其受體的表達，這一發(fā)現(xiàn)與VEGF在鹿茸血管生成中的作用是一致的。VEGF的生物學(xué)特性主要表現(xiàn)在：增加微血管的通透性，促進血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂和增殖，進而導(dǎo)致新生血管的生成，VEGF主要是通過與其受體的結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用[14]。

MicroRNA是所有小分子非編碼RNA中研究得最多也最為深入的。它是真核生物細(xì)胞中存在的一類小調(diào)控RNA，它們基于與靶mRNA序列互補，可以降解靶mRNA和抑制蛋白質(zhì)翻譯，從而對生物體基因表達起到精細(xì)調(diào)節(jié)的作用。miRNA的功能主要是調(diào)節(jié)生物體內(nèi)與機體生長、發(fā)育、疾病發(fā)生過程有關(guān)的基因的表達。在動物的全部基因中，miRNA參與了30%左右基因的表達調(diào)控，包括大多數(shù)生長、發(fā)育、癌癥發(fā)生等生理機制[15-16]。目前，對鹿miRNA的鑒定、表達譜分析及功能研究知之甚少，而miRNA介導(dǎo)的表達調(diào)控方式是基因表達調(diào)控機制中不可缺少的重要組成部分，發(fā)現(xiàn)和鑒定特定組織細(xì)胞發(fā)育階段中特定非編碼RNA及其在基因表達調(diào)控中的具體作用是當(dāng)前及今后一段時間內(nèi)功能基因組學(xué)研究的熱點之一。因此，鑒于鹿茸獨特的生理作用，本課題首先在克隆獲得VEGF基因3′UTR序列的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)軟件分析其3′UTR序列中存在的miRNA位點共31個，再結(jié)合本課題組以往制備的鹿茸頂端不同組織miRNA芯片結(jié)果，篩選出9種可調(diào)控VEGF基因的靶miRNA，發(fā)現(xiàn)其中miRNA-93-5p是鹿茸頂端不同組織中差異表達最明顯的。據(jù)此，選擇miRNA-93-5p進行后續(xù)的研究。同時，熒光素酶活性檢測系統(tǒng)進一步驗證了VEGF是miRNA-93-5p調(diào)控的靶基因。在此基礎(chǔ)上，將人工合成的miRNA模擬物轉(zhuǎn)染至鹿茸細(xì)胞后模擬內(nèi)源性miRNA發(fā)揮作用。MTT法檢測結(jié)果表明，與對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-93-5p的細(xì)胞增殖受到抑制，VEGF蛋白的表達水平有所下降，且呈時間依賴性。這些結(jié)果證明了miRNA-93-5p對VEGF具有一定的調(diào)控作用，進而對鹿茸軟骨細(xì)胞的體外增殖具有抑制作用。

近年來，國內(nèi)外眾多學(xué)者對鹿茸角可完全再生這一特殊的動物學(xué)生命現(xiàn)象給予了高度的關(guān)注。而相對于其他哺乳動物來說，鹿miRNA的研究相對較少。本研究發(fā)現(xiàn)，在鹿茸軟骨細(xì)胞的快速生長中，miRNA可以抑制VEGF的表達。從RNA水平上探討了miRNA在鹿茸生長發(fā)育中的調(diào)控作用。不僅保存了鹿這一我國珍貴物種的基因資源，也為從根本上闡明鹿茸生長的分子機理提供了新的參考依據(jù)。

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Transcription Regulation Effect of miRNA-93-5p on VEGF Gene and Its Relationship with Antler Cell Proliferation

/Li Lu, Li Ting, Li Mu, Wu Yan, Qi Lin, Cui Dongming, Hu Wei

(Jilin Agricultural University, Changchun 130118, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(11).-146～149

We isolated the cartilage cells from antler tip and extracted cells total RNA by Trizol reagent to explore the effect transcriptional regulation of miRNA-93-5p on vascular endothelial growth factor (VEGF) and the relationship with the growth of antler cells, and synthesized cDNA by reverse transcription. With the published relative sequence in GenBank, we designed and cloned the specially primers of 3’UTR of sika deer VEGF gene, constructed dual luciferase reporter gene vectors of VEGF gene 3’UTR containing wild-type or mutant sequence, and detected the relative activity of luciferase. We detected the changes of the in vitro proliferation of cartilage cells by MTT after transfected cartilage cells using miRNA-93-5p mimics, and analyzed the expression abundance of VEGF protein by western blotting. We obtained 3’UTR sequence of VEGF from antler tissue. The length of wild-type sequence is 356 bp and the length of mutant sequence is 336 bp. Luciferase activity detection indicates that the luciferase activity of the wild-type plasmid transfected cells is reduced, whereas mutant cells have no obvious change of luciferase activity. By MTT assay and western blotting, antler cells are inhibitedinvitroand the expression level of VEGF protein decrease along with the time increase.

Antler cells; miRNA-93-5p; Vascular endothelial growth factor; Transcriptional regulation; Cell proliferation

1) 國家自然科學(xué)基金(30972083)；吉林省科技發(fā)展計劃項目(20090574)。

李璐，女，1990年11月生，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，碩士研究生。

胡薇，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，副教授。E-mail:huwei9002@126.com。

2014年4月1日。

Q786

責(zé)任編輯：程 紅。