ORP調(diào)控對葡萄糖和果糖混合底物丁醇發(fā)酵的影響

齊高相，吳又多，陳麗杰，萬慧慧，白鳳武，3

（1大連理工大學生命科學與技術學院，遼寧 大連116023；2大連理工大學化學分析測試中心，遼寧 大連116023；3上海交通大學生命科學技術學院，上海200240）

與好氧發(fā)酵過程相比，厭氧發(fā)酵過程由于缺少合適的控制參數(shù)而難以進行過程優(yōu)化。氧化還原電位（oxidoreduction potential，ORP）調(diào)控作為一種新的過程調(diào)控手段已經(jīng)應用于很多厭氧發(fā)酵過程，比如1，3－丙二醇發(fā)酵［1］、木糖醇發(fā)酵［2］、丙酸發(fā)酵［3］、乳 酸 發(fā) 酵［4］和 丁 醇 發(fā) 酵［5］等 生 物 過 程工藝。

ORP是綜合反映發(fā)酵培養(yǎng)基pH值、溶解氧濃度、電解質(zhì)電勢和平衡常數(shù)的參數(shù)［6］，在所有生物的生命過程中起到很重要的作用［7］，每一菌種甚至是每一菌株都有最利于其生長的ORP范圍。ORP不僅與培養(yǎng)基理化性質(zhì)有關，而且能夠反應菌體內(nèi)部氧化還原狀態(tài)［8］。通過蛋白膜電勢（protein film voltammery，PFV）技術將酶分子固定到ORP電極上，測定許多與氧化還原反應有關的酶的活性隨ORP變化，結(jié)果表明酶分子有其最佳的ORP水平［9］。因此，可以通過調(diào)節(jié)ORP影響酶的活性進而影響胞內(nèi)代謝流分布，最終可有效提高目標產(chǎn)物發(fā)酵終點產(chǎn)量。

菊芋具有生長適應性強，產(chǎn)量高等天然作物優(yōu)勢，且菊芋塊莖相對木質(zhì)纖維素原料更易水解而獲得可發(fā)酵糖，可作為生物丁醇發(fā)酵生產(chǎn)的理想底物［10－11］。然而，由于菊芋塊莖酸解液中的發(fā)酵糖主要為葡萄糖和果糖的混合糖體系，菌體在以混合糖為底物進行的丁醇發(fā)酵過程中存在顯著的碳源阻遏效應（carbon catabolite repression，CCR），即菌體細胞優(yōu)先利用葡萄糖，果糖利用極其緩慢，直至葡萄糖消耗殆盡后果糖代謝才開始緩慢進行。丁醇發(fā)酵過程是典型的雙相發(fā)酵體系，即菌體首先主要代謝生成乙酸和丁酸，稱為產(chǎn)酸期；隨后再將二者吸收轉(zhuǎn)化生成丙酮、丁醇和乙醇等主要溶劑稱為產(chǎn)溶劑期［12］。產(chǎn)酸階段優(yōu)先利用葡萄糖產(chǎn)生的大量有機酸尤其是丁酸對細胞有毒性［13－14］。因此CCR效應和丁酸毒性使菌體細胞無法從產(chǎn)酸期順利轉(zhuǎn)變到產(chǎn)溶劑期而導致有機酸過度積累，最終使得發(fā)酵提前終止［15］，即典型的“酸崩潰”現(xiàn)象［16］。

通過前期研究表明，控制以葡萄糖和果糖混合糖為底物的丁醇發(fā)酵過程的ORP不低于－460mV能夠有效防止“酸崩潰”現(xiàn)象的發(fā)生。本文通過對比最佳ORP調(diào)控下的發(fā)酵過程與無控ORP發(fā)酵過程的底物消耗，菌體生長，產(chǎn)物生成以及胞內(nèi)關鍵代謝物含量（輔酶A酯類化合物，能量狀態(tài)，還原力水平和糖酵解途徑中間化合物），旨在探究ORP調(diào)控對以葡萄糖和果糖混合糖為底物的丁醇發(fā)酵過程的影響。

1 實驗材料和方法

1.1 菌種

作者實驗室馴化保存的丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌ClostridiumacetobutylicumL7。

1.2 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基（g／L）：葡萄糖11，果糖44，乙酸銨2.76，K2HPO40.5，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.01，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，對氨基苯甲酸0.01，生物素0.01，酵母粉2，初始pH值5.5。

滅菌前向裝有活化培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的點滴瓶充氮氣5min，壓蓋。

培養(yǎng)基滅菌條件均為121℃，15min。

1.3 培養(yǎng)條件

菌種活化培養(yǎng)：將5mL冷凍保藏的菌種接種于裝有100mL活化培養(yǎng)基點滴瓶中，37.5℃培養(yǎng)20h。

種子培養(yǎng)：將充分活化的菌種以10%的接種量接種于100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37.5℃培養(yǎng)24h。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：預先向裝有滅菌后培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中通無菌氮氣30min，以排除發(fā)酵培養(yǎng)基中溶解的氧氣，然后將經(jīng)過搖瓶擴大培養(yǎng)后的種子接入發(fā)酵罐中，接種量10%，設定攪拌轉(zhuǎn)速150r／min，溫度37.5℃。

例如，教師可以將學生分成不同小組，合作探究教材中的案例，自主搜集資料，從不同角度進行思考，無形中鍛煉學生解決問題和分析整理的能力。此外，學生在小組學習中更容易積極表達自身的不同看法，在提高自主學習積極性和會計專業(yè)核心素養(yǎng)的同時，啟迪智慧，將學生快速培養(yǎng)成社會所需人才。

1.4 ORP調(diào)控策略

控制發(fā)酵全程ORP不低于－460mV將ORP電極顯示系統(tǒng)連接繼電器和控制器（蠕動泵），當ORP顯示數(shù)值低于－460mV時，繼電器吸合，自動開啟控制器，系統(tǒng)通過控制器向發(fā)酵培養(yǎng)基泵入無菌空氣直至ORP顯示數(shù)值高于－457mV停止。隨著發(fā)酵進行，ORP發(fā)生變化，當ORP顯示數(shù)值再次到達－460mV時，系統(tǒng)按上述方式開啟新的調(diào)控。通過調(diào)控裝置可以控制發(fā)酵全過程ORP下限不低于－460mV。

1.5 分析方法

1.5.1 菌體濃度測定方法

在620nm處測定菌體的吸光度作為菌體濃度（OD620），細胞干重（dry cell weight，DCW，g／L）由以下公式計算得到。

DCW＝0.8009×OD620

1.5.2 糖濃度測定

葡萄糖濃度使用SBA－40C生物傳感分析儀（山東省科學院生物研究所）測定，總還原糖濃度采用DNS法測定，果糖濃度為總還原糖濃度與葡萄糖濃度之差。

1.5.3 丙酮、丁醇及乙醇濃度的測定

發(fā)酵液中丙酮、丁醇和乙醇濃度采用氣相色譜法測定。色譜分離條件：毛細管色譜柱Agilent HP－INNOWAX（30cm×0.25mm×0.50μm），柱溫：100℃，進樣口溫度250℃，F(xiàn)ID檢測器溫度300℃，H2流速40mL／min，空氣流速400mL／min，載氣N2流速30mL／min，進樣量0.2μL，分流比50∶1，內(nèi)標物為異丁醇。

1.5.4 乙酸和丁酸濃度的測定

乙酸和丁酸濃度使用Waters 1525高效液相色譜測定，色譜分離條件：Aminex HPX－87H有機酸分析柱（30cm×7.8mm；Bio－Rad，Hercules），流動相為5mmol／L H2SO4，流速0.5mL／min，進樣量20μL，柱溫50℃，PDA檢測器檢測波長210nm。

1.5.5 胞內(nèi)關鍵代謝物提取和測定

（1）淬滅方法

用注射器快速抽取10mL發(fā)酵液，加入到裝有30mL，預冷至－40℃、60%甲醇（體積比，下同）的50mL離心管中，搖勻，瞬間淬滅。

（2）提取方法

發(fā)酵液和甲醇淬滅液混合均勻后在－10℃10000r／min離心5min。離心完畢去上清，沉淀加5mL預冷至－40℃、60%的甲醇洗滌，再次離心，條件同上。沉淀加入1mL、75%的乙醇，混勻后放入90℃水浴中加熱10min，加熱完畢后放入液氮中迅速冷卻。將樣品取出解凍后在－10℃10000r／min離心8min，上清液用于LC－ESI／MS法對代謝物進行定量分析。

（3）LC－ESI／MS分析條件

色譜條件：色譜柱為X Bridge BEH Amide Column XP（2.5μm，2.1×100mm，Waters）；柱溫25℃；流動相A為10mmol／L醋酸氨溶液，流動相B為乙腈；梯度洗脫，洗脫條件見表1，流速200μL／min；進樣量10μL。

表1 液質(zhì)聯(lián)用梯度洗脫條件

質(zhì)譜條件：TSQ Quantum Ultra液質(zhì)聯(lián)用儀（Thermo Scientific）；電噴霧離子源（Electrospray ionization，ESI）；離子化模式為正模式和負模式；噴霧電壓3.0kV（正離子掃描模式），2.5kV（負離子掃描模式）；鞘氣設定為35units，輔助氣設定為10units；離子源氣化溫度250℃；毛細管溫度340℃；掃描采用選擇反應監(jiān)測（selected reaction monitoring，SRM）模式；采集時間均為0.2s，碰撞氣采用氬氣，碰撞氣壓力1.5mTorr。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵過程中的菌體生長、底物消耗和產(chǎn)物生成

以混合糖為底物，ORP調(diào)控下的丁醇發(fā)酵和無控ORP條件下的丁醇發(fā)酵結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明ORP調(diào)控能夠顯著提高發(fā)酵過程混合糖尤其是果糖的利用率，有效降低發(fā)酵終點殘?zhí)菨舛炔⑻岣甙l(fā)酵過程中的菌體濃度和溶劑產(chǎn)量。發(fā)酵終點時，空白對照組和ORP調(diào)控組葡萄糖均被完全消耗，空白對照組果糖剩余30.82g／L，而ORP調(diào)控組果糖剩余僅為1.38g／L。ORP調(diào)控組，發(fā)酵時間為96h，但是空白對照組在發(fā)酵72h以后，發(fā)酵液中溶劑、有機酸及殘?zhí)菨舛茸兓瘶O其微弱，發(fā)酵出現(xiàn)提前終止的特征。丁醇發(fā)酵過程是典型的雙相發(fā)酵，即菌體首先主要代謝生成乙酸和丁酸，隨后再將二者吸收轉(zhuǎn)化生成丙酮、丁醇和乙醇等主要溶劑。表2結(jié)果表明發(fā)酵終點的有機酸濃度差別不大，但從圖1的pH值變化曲線可以看出，有機酸的積累過程不同。在ORP調(diào)控下的丁醇發(fā)酵過程存在著兩個明顯的有機酸重吸收階段，分別出現(xiàn)在葡萄糖代謝階段（12h到24h）和果糖代謝階段（60h到72h），發(fā)酵后期培養(yǎng)基中的有機酸積累是第二階段重吸收后產(chǎn)生的。而空白對照組發(fā)酵過程中僅存在一個明顯的有機酸重吸收過程，即出現(xiàn)在葡萄糖代謝階段（12h到24h），果糖緩慢代謝所產(chǎn)生的有機酸由于缺乏足夠的還原力而無法被重吸收。

表2 ORP調(diào)控組與及空白對照組的丁醇發(fā)酵結(jié)果

2.2 發(fā)酵過程中的pH值和ORP變化

如圖1所示，在整個發(fā)酵過程中，ORP調(diào)控組的pH值高于空白對照組pH值，說明在不進行ORP調(diào)控的發(fā)酵過程中有更多的有機酸積累，因此菌體受到有機酸尤其是丁酸的毒害作用更強，導致“酸崩潰”現(xiàn)象的發(fā)生。對比發(fā)酵全程ORP變化可以發(fā)現(xiàn)，ORP調(diào)控的發(fā)酵過程ORP變化曲線在24h到60h之間有一個明顯的波形突起（－423mV到－460mV），在這個波形突起的期間，發(fā)生從產(chǎn)酸期到產(chǎn)溶劑期的轉(zhuǎn)變［17］?？瞻讓φ战M的ORP在達到最低點（－516mV）后開始緩慢上升，相應的，在果糖緩慢代謝利用的發(fā)酵過程中未出現(xiàn)明顯的有機酸重吸收過程，實驗結(jié)果表明ORP的變化與從產(chǎn)酸期到產(chǎn)溶劑期的轉(zhuǎn)變之間存在一定關聯(lián)性。

2.3 發(fā)酵過程中胞內(nèi)關鍵代謝物含量變化

為探究以葡萄糖和果糖混合糖為底物的丁醇發(fā)酵過程中發(fā)生“酸崩潰”的原因和ORP調(diào)控機理，對代謝過程中的胞內(nèi)關鍵代謝物進行了提取和定量分析，結(jié)果為兩組批次重復實驗結(jié)果的平均值。主要對關鍵的輔酶A酯類化合物，能量狀態(tài)，還原力水平和糖酵解途徑中間化合物進行了分析，待測化合物的質(zhì)譜測定條件優(yōu)化結(jié)果見表3。

圖1 空白對照組和ORP調(diào)控組發(fā)酵過程中pH值和ORP變化曲線

表3 SRM模式下使用的代謝物質(zhì)譜碰撞參數(shù)

輔酶A酯類化合物在丁醇代謝合成過程中非常重要，從糖酵解過程產(chǎn)生的丙酮酸生成乙酰輔酶A過程開始，輔酶A酯類化合物經(jīng)過逐步還原，生成丁醇。對比圖2（a）和圖2（b）不難看出，在24h到72h之間，空白對照組和ORP調(diào)控組的輔酶A酯類化合物含量變化趨勢明顯不同。空白對照組，在24h到48h之間，菌體產(chǎn)酸較快，生成輔酶A酯類化合物，所以輔酶A酯類化合物含量呈上升趨勢，在48h到72h之間，由于有機酸對細胞的毒害導致細胞裂解，從而導致輔酶A酯類化合物含量下降。ORP調(diào)控組，在24h到36h之間，有機酸還在進行微弱的重吸收過程，所以輔酶A酯類化合物含量稍有下降，在36h到60h之間，由于菌體利用果糖產(chǎn)酸，輔酶A酯類化合物濃度升高，在60h到72h之間，有機酸快速被重吸收，輔酶A酯類化合物含量也出現(xiàn)明顯下降。

圖2 空白對照組和ORP調(diào)控組發(fā)酵過程中輔酶A酯類化合物含量變化曲線

對于丙酮丁醇梭菌，其細胞內(nèi)部pH值比外界環(huán)境要高，以維持其生長和代謝活動正常進行［18］。在丁醇發(fā)酵過程中菌體自身產(chǎn)生的乙酸和丁酸會對細胞產(chǎn)生毒性，尤其是丁酸的解偶聯(lián)作用能夠降低菌體維持細胞內(nèi)外ΔpH的能力。當菌體內(nèi)pH值降低時，菌體就會采用消耗ATP的方式將細胞內(nèi)的H＋外排。因此，通過細胞內(nèi)ATP含量可以推測菌體對外部有機酸毒性的抵抗能力。對比圖3（a）和圖3（b）可以看出，菌體在快速利用葡萄糖時大量生成ATP，在24h到60h之間ATP含量非常低，大量ATP被用于抵抗外部有機酸的毒性。對于空白對照組，整個發(fā)酵過程ATP含量呈單調(diào)下降趨勢，直至發(fā)酵結(jié)束。而ORP調(diào)控下，菌體在經(jīng)歷了36h的極低ATP水平后，由于有機酸重吸收開啟，菌體開始快速生成ATP。從發(fā)酵36h至發(fā)酵結(jié)束，ORP調(diào)控組菌體內(nèi)的能荷（energy charge，EC）高于空白對照組，表明ORP調(diào)控對細胞內(nèi)的能量狀態(tài)有調(diào)節(jié)作用。

圖3 空白對照組和ORP調(diào)控組發(fā)酵過程中能量狀態(tài)變化曲線

細胞內(nèi)眾多的反應都受到NADH和NAD＋比例的調(diào)節(jié)，對于丁醇發(fā)酵而言，每生成1mol丁醇需要消耗4mol NADH。因此NADH和NAD＋的水平對于丁醇發(fā)酵而言至關重要。嚴格厭氧的丙酮丁醇梭菌解除氧毒害作用機理方面直接與NADH和NAD＋水平有關［19］，因此通過向培養(yǎng)基中通入無菌空氣調(diào)節(jié)發(fā)酵過程的培養(yǎng)基ORP對于菌體內(nèi)的NADH和NAD＋水平也有著重要的調(diào)節(jié)作用。對比圖4（a）和圖4（b）發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵初期菌體利用葡萄糖迅速產(chǎn)酸，NADH大量生成，NADH／NAD＋也較高，空白對照組和ORP調(diào)控組NADH／NAD＋均為0.27。隨后隨著有機酸重吸收過程進行，NADH逐漸被消耗。在24h到60h之間，空白對照組NADH／NAD＋呈下降趨勢，而ORP調(diào)控下NADH／NAD＋上先升后下降，表明ORP調(diào)控能夠調(diào)整細胞內(nèi)還原力水平。在24h到60h期間，NADH／NAD＋一直處于0.03到0.09的較低水平，使得從產(chǎn)酸期到產(chǎn)溶劑期過渡緩慢，延長了發(fā)酵時間。

圖4 空白對照組和ORP調(diào)控組發(fā)酵過程中還原力水平變化曲線

磷酸化是葡萄糖和果糖進入細胞的第一步反應，細胞內(nèi)磷酸化糖類的水平在一定程度上能夠反映糖類進入細胞情況以及糖酵解過程的強弱。為了考察ORP調(diào)控組和空白對照組發(fā)酵過程中菌體對糖的利用，對胞內(nèi)己糖單磷酸和己糖二磷酸含量進行了比較。對比圖5（a）和圖5（b）可以看出，在發(fā)酵前48h空白對照組和ORP調(diào)控組己糖單磷酸和己糖二磷酸含量變化趨勢相同，都呈單調(diào)下降趨勢，因為菌體在發(fā)酵前24h快速利用葡萄糖，糖酵解作用強，在24h到48h之間，糖酵解作用減弱，胞內(nèi)己糖單磷酸和己糖二磷酸含量下降。在48h以后，在ORP調(diào)控組和空白對照組胞內(nèi)己糖單磷酸和己糖二磷酸含量出現(xiàn)相反趨勢，空白對照組中有機酸的毒害作用導致菌體逐漸裂解死亡，胞內(nèi)己糖單磷酸和己糖二磷酸含量也出現(xiàn)下降，而ORP調(diào)控組菌體葡萄糖利用完畢并經(jīng)過一段延遲時間后，開始快速利用果糖進行糖酵解，胞內(nèi)己糖單磷酸和己糖二磷酸含量快速升高。ORP調(diào)控組發(fā)酵72h以后胞內(nèi)己糖單磷酸和己糖二磷酸含量開始下降，這是因為隨著發(fā)酵液中丁醇濃度的提高，細胞活性降低，對糖的利用減慢，糖酵解作用開始減弱。丙酮酸是糖酵解代謝途徑的終產(chǎn)物，丙酮酸到乙酰輔酶A代謝流決定了底物碳流流向溶劑的多少。對比圖5（a）和圖5（b）可以看出，在12h和24h之間，ORP調(diào)控組的丙酮酸含量要高于空白對照組，這可能是由于通氣改變了丙酮酸到乙酰輔酶A的代謝流向。因為丙酮酸經(jīng)酶催化裂解形成乙酰輔酶A的代謝途徑有兩條，一條代謝途徑是丙酮酸經(jīng)丙酮酸脫氫酶復合體催化裂解生成乙酰輔酶A和CO2，另一條代謝途徑是丙酮酸經(jīng)嚴格厭氧的丙酮酸甲酸裂解酶催化生成甲酸和乙酰輔酶A［20］，通空氣能夠抑制丙酮酸甲酸裂解酶活性從而使丙酮酸含量上升。另外，ORP調(diào)控條件下的發(fā)酵過程中，由于氧氣的脅迫導致胞內(nèi)海藻糖含量的提高。這一現(xiàn)象已在對釀酒酵母進行的乙醇發(fā)酵研究中得到驗證，在高乙醇濃度、高滲透壓、溶解氧和熱等外界脅迫條件下，釀酒酵母胞內(nèi)海藻糖含量也有提高［21－24］。

圖5 空白對照組和ORP調(diào)控組發(fā)酵過程中糖酵解途徑中間化合物和海藻糖含量變化曲線

3 結(jié) 論

葡萄糖和果糖混合糖模擬菊芋塊為底物的丁醇發(fā)酵過程中存在的果糖利用率和丁醇產(chǎn)量低，有機酸積累過多等問題，其原因主要是菌體細胞內(nèi)還原力不足，發(fā)酵后期難以實現(xiàn)產(chǎn)酸期向產(chǎn)溶劑期的轉(zhuǎn)變，致使發(fā)酵體系有機酸尤其是丁酸過量積累，最終導致發(fā)酵提前終止。本工作采取ORP調(diào)控的方式調(diào)節(jié)以葡萄糖和果糖混合糖為底物的丁醇發(fā)酵過程，通過改變發(fā)酵過程中細胞內(nèi)還原力水平，能量狀態(tài)和碳源代謝流向，實現(xiàn)對發(fā)酵過程調(diào)控，使發(fā)酵終點丁醇濃度由ORP調(diào)控前的3.39g／L提高到11.65g／L。研究結(jié)果證明ORP調(diào)控是一種簡單而有效的丁醇發(fā)酵工藝優(yōu)化策略，能夠有效緩解以葡萄糖和果糖混合糖為底物的丁醇發(fā)酵過程中出現(xiàn)的“酸崩潰”現(xiàn)象。

［1］ Du C，Yan H，Zhang Y，et al.Use of oxidoreduction potential as an indicator to regulate 1，3－propanediol fermentation byKlebsiellapneumoniae［J］.Applied MicrobiologyandBiotechnology，2006，69（5）：554－563.

［2］ Sheu D C，Duan K J，Jou S R，et al.Production of xylitol fromCandidatropicalisby using an oxidation－reduction potential－stat controlled fermentation［J］.Biotechnology Letters，2003，25（24）：2065－2069.

［3］ Chen F，F(xiàn)eng X H，Liang J F，et al.An oxidoreduction potential shift control strategy for high purity propionic acid production byPropionibacteriumfreudenreichiiCCTCC M207015with glycerol as sole carbon source［J］.BioprocessandBiosystemsEngineering，2013，36（9）：1165－1176.

［4］ 鄭繼岱，徐國謙，儲炬，等.利用氧化還原電位調(diào)控乳酸發(fā)酵［J］.生物加工過程，2008，5（6）：73－77.

［5］ Wang S，Zhu Y，Zhang Y，et al.Controlling the oxidoreduction potential of the culture ofClostridium acetobutylicumleads to an earlier initiation of solventogenesis，thus increasing solvent productivity［J］.AppliedMicrobiologyandBiotechnology，2012，93（3）：1021－1030.

［6］ Ishizaki A，Shibai H，Hirose Y.Basic aspects of electrode potential change in submerged fermentation［J］.AgriculturalandBiologicalChemistry，1974，38：2399－2405.

［7］ Li J，Jiang M，Chen K Q，et al.Effect of redox potential regulation on succinic acid production byActinobacillus succinogenes［J］.BioprocessandBiosystemsEngineering，2010，33（8）：911－920.

［8］ De Graef M R，Alexeeva S，Snoep J L，et al.The steadystate internal redox state（NADH／NAD）reflects the external redox state and is correlated with catabolic adaptation inEscherichiacoli［J］.Journalof Bacteriology，1999，181（8）：2351－2357.

［9］ Elliott S J，Léger C，Pershad H R，et al.Detection and interpretation of redox potential optima in the catalytic activity of enzymes［J］.BiochimicaetBiophysicaActa（BBA）：Bioenergetics，2002，1555（1）：54－59.

［10］ Margaritis A，Bajpai P，Cannell E.Optimization studies for the bioconversion of Jerusalem artichoke tubers to ethanol and microbial biomass［J］.BiotechnologyLetters，1981，3（10）：595－599.

［11］ 陳曉明，金征宇.菊粉降解生產(chǎn)低聚果糖［J］.飼料工業(yè)，2000，21（11）：29－31.

［12］ Fond O，Matta－Ammouri G，Petitdemange H，et al.The role of acids on the production of acetone and butanol byClostridiumacetobutylicum［J］.AppliedMicrobiology andBiotechnology，1985，22（3）：195－200.

［13］ Herrero A A，Gomez R F，Snedecor B，et al.Growth inhibition ofClostridiumthermocellumby carboxylic acids：a mechanism based on uncoupling by weak acids［J］.AppliedMicrobiologyandBiotechnology，1985，22（1）：53－62.

［14］ Huesemann M，Papoutsakis E T.Effect of acetoacetate，butyrate，and uncoupling ionophores on growth and product formation ofClostridiumacetobutylicum［J］.Biotechnology Letters，1986，8（1）：37－42.

［15］ 鄧攀，陳麗杰，辛程勛，等.果糖及葡萄糖混合物為底物的丙酮 丁 醇 發(fā) 酵［J］.生 物 工 程 學 報，2011，27（10）：1448－1456.

［16］ Maddox I S，Steiner E，Hirsch S，et al.The cause of“acid crash”and“acidogenic fermentations”during the batch acetone－butanol－ethanol（ABE－）fermentation process［J］.JournalofMolecularMicrobiologyandBiotechnology，2000，2（1）：95－100.

［17］ Peguin S，Goma G，Delorme P，et al.Metabolic flexibility ofClostridiumacetobutylicumin response to methyl viologen addition［J］.AppliedMicrobiologyand Biotechnology，1994，42（4）：611－616.

［18］ Huang L，Gibbins L N，F(xiàn)orsberg C W.Transmembrane pH gradient and membrane potential inClostridium acetobutylicumduring growth under acetogenic and solventogenic conditions［J］.AppliedandEnvironmental Microbiology，1985，50（4）：1043－1047.

［19］ Kawasaki S，Sakai Y，Takahashi T，et al.O2and reactive oxygen species detoxification complex，composed of O2－responsive NADH：Rubredoxin oxidoreductase－flavoprotein A2－desulfoferrodoxin operon enzymes，rubperoxin，and rubredoxin，inClostridiumacetobutylicum［J］.Appliedand EnvironmentalMicrobiology，2009，75（4）：1021－1029.

［20］ N?lling J，Breton G，Omelchenko M V，et al.Genome sequence and comparative analysis of the solvent－producing bacteriumClostridiumacetobutylicum［J］.Journalof Bacteriology，2001，183（16）：4823－4838.

［21］ 申渝，葛旭萌，李寧，等.高濃度乙醇連續(xù)發(fā)酵振蕩過程中代謝通量分析及誘發(fā)機理［J］.化工學報，2009（6）：1519－1528.

［22］ Sharma S C.A possible role of trehalose in osmotolerance and ethanol tolerance inSaccharomycescerevisiae［J］.FEMSMicrobiologyLetters，1997，152（1）：11－15.

［23］ Benaroudj N，Lee D H，Goldberg A L.Trehalose accumulation during cellular stress protects cells and cellular proteins from damage by oxygen radicals［J］.Journalof BiologicalChemistry，2001，276（26）：24261－24267.

［24］ Hottiger T，Virgilio C，Hall M N，et al.The role of trehalose synthesis for the acquisition of thermotolerance in yeast［J］.EuropeanJournalofBiochemistry，1994，219（1－2）：187－193.