邱念偉,楊翠翠, 盧正珂, 李遵寧, 岳賢軍, 程秀秀, 許瑩瑩, 周 峰

(1. 曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 曲阜 273165; 2. 南京曉莊學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院， 南京 211171)

蒔蘿蒿適應(yīng)鹽漬環(huán)境的Na+區(qū)域化方式和生理特征

邱念偉1,楊翠翠1, 盧正珂1, 李遵寧1, 岳賢軍1, 程秀秀1, 許瑩瑩1, 周 峰2,*

(1. 曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 曲阜 273165; 2. 南京曉莊學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院， 南京 211171)

蒔蘿蒿是廣泛分布在我國北方的一種特殊類型的菊科鹽生植物，闡明蒔蘿蒿特殊的耐鹽機(jī)制和生理特征有助于豐富植物抗鹽性研究的內(nèi)容。用0、100、200、300、400 mmol/L NaCl處理蒔蘿蒿7 d后，比較蒔蘿蒿鹽處理植株與對照植株在生長和生理方面的差異，并詳細(xì)分析了Na+在蒔蘿蒿體內(nèi)的積累水平和區(qū)域化方式。結(jié)果顯示：蒔蘿蒿雖然能夠耐受400 mmol/L NaCl，但鹽處理顯著抑制了蒔蘿蒿的生長，整株鮮重隨著鹽處理濃度的升高逐漸減小。在水分生理方面，隨著鹽處理濃度的升高，蒔蘿蒿葉片細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力逐漸增強(qiáng)，其葉片肉質(zhì)化程度卻呈逐漸降低的趨勢。分析鹽處理對光合作用的影響發(fā)現(xiàn)，鹽處理后蒔蘿蒿葉片光合速率與氣孔導(dǎo)度顯著下降，而其PSⅡ光化學(xué)活性并未受到抑制，葉綠素含量甚至逐漸增大，說明鹽處理后蒔蘿蒿葉片光合速率的降低主要是由于氣孔因素造成的，而不是由于光合結(jié)構(gòu)被破壞。蒔蘿蒿體內(nèi)的Na+含量隨著鹽處理濃度的升高顯著增加，400 mmol/L NaCl條件下葉、莖、根中的Na+含量分別高達(dá)321.4、242.1和182.3 μmol/g鮮重；蒔蘿蒿體內(nèi)的Na+70%以上積累在葉片內(nèi)，而葉片內(nèi)98%左右的Na+積累在葉片原生質(zhì)體中，葉片原生質(zhì)體中的Na+平均濃度是質(zhì)外體1.2—1.8倍，推測其葉片細(xì)胞內(nèi)存在著有效的Na+區(qū)域化機(jī)制。鹽處理后蒔蘿蒿葉片液泡膜V-H+-ATPase的質(zhì)子泵活性比對照增加了30%—50%，液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性則增加至對照的4—7倍，進(jìn)一步證實(shí)蒔蘿蒿葉片具有較強(qiáng)的液泡Na+區(qū)域化能力。隨著鹽處理濃度的升高，Na+在葉片中的分布比例相對減少，V-H+-ATPase的質(zhì)子泵活性和Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性增幅也減緩。這種Na+區(qū)域化能力使蒔蘿蒿獲得了較強(qiáng)的耐鹽性，有效保護(hù)了其光系統(tǒng)，降低了細(xì)胞汁液滲透勢。但是鹽處理后這種耐鹽方式并不能阻止蒔蘿蒿葉片肉質(zhì)化程度和光合活性下降，蒔蘿蒿生長仍然受鹽抑制，說明Na+區(qū)域化是蒔蘿蒿適應(yīng)鹽漬環(huán)境的必要條件而非充分條件。

蒔蘿蒿；Na+區(qū)域化；生長；光合；適應(yīng)

蒔蘿蒿(ArtemisiaanethifoliaMattf)廣泛分布在我國北方鹽堿地區(qū)，是一種特殊的菊科鹽生植物，它既不具備真鹽生植物的快速生長及稀鹽能力，又不具備泌鹽植物的泌鹽結(jié)構(gòu)，也不具備拒鹽植物有效的拒鹽方式[1]，卻能夠在高鹽條件下生存并完成生活史。因此蒔蘿蒿的耐鹽機(jī)制具有特殊性，但其耐鹽機(jī)制還未見報道。在鹽漬條件下蒔蘿蒿吸收了大量的Na+并能夠使細(xì)胞質(zhì)中的代謝活動不受傷害，說明其具有非常有效的Na+區(qū)域化方式。本文擬從個體、組織和細(xì)胞3個水平上分析蒔蘿蒿在鹽漬條件下的離子區(qū)域化方式和生理特征，闡述其耐鹽機(jī)制。

在前人提出的眾多耐鹽機(jī)制中，最受關(guān)注的是Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它廣泛存在于生物膜上，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞pH值和Na+平衡的作用[2- 5]。通過轉(zhuǎn)Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白已經(jīng)使近百種鹽敏感植物獲得了耐鹽性，充分證實(shí)了Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物耐鹽性中的作用[6- 9]。但是這些通過轉(zhuǎn)Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因獲得耐鹽性的植物雖然耐鹽能力提高，但其仍然不能真正“適應(yīng)”鹽漬環(huán)境?！斑m應(yīng)”是指植物處于不適宜的環(huán)境時，能夠通過自身的形態(tài)或生理變化，將環(huán)境的不利影響降到最低，并最大限度地利用環(huán)境的有益因素，使植物達(dá)到最佳的生活狀態(tài)[10]。能夠真正“適應(yīng)”鹽漬環(huán)境的植物叫做真鹽生植物，真鹽生植物主要分布在藜科植物中，如堿蓬屬、濱藜屬、豬毛菜屬和鹽穗木屬等。這類植物的特征是“喜鹽”，適當(dāng)?shù)柠}度能夠促進(jìn)其生長，如堿蓬最適鹽濃度是200—300 mmol/L NaCl[11]。但是，包括蒔蘿蒿、蘆葦、二色補(bǔ)血草在內(nèi)的很多鹽生植物在鹽漬環(huán)境下生長均受到抑制，因此它們均不是真鹽生植物，通過轉(zhuǎn)基因獲得耐鹽性的植物也均沒有達(dá)到“適鹽性”目標(biāo)[6- 9,12]。鹽漬環(huán)境對非真鹽生植物來講仍然是一種脅迫，而對真鹽生植物來講則是一種適宜環(huán)境，Na+是真鹽生植物重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[11,13]。以蒔蘿蒿為代表植物，分析其Na+區(qū)域化機(jī)制和生長特征，有助于了解這類非適鹽植物耐鹽但不能“適鹽”的主要原因，為植物耐鹽性研究提供新內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)

蒔蘿蒿(Artemisiaanethifolia)的種子采自黃河三角洲。挑選籽粒飽滿的種子播種于裝有干凈細(xì)砂的塑料盆內(nèi)，當(dāng)幼苗長到4—5個葉片時，選取生長一致幼苗進(jìn)行液體通氣培養(yǎng)。水培幼苗適應(yīng)2 d后進(jìn)行NaCl處理，方法是用含有NaCl的完全Hoagland營養(yǎng)液(pH值5.9)每天遞增100 mmol/L NaCl，同一天達(dá)到處理終濃度(100、200、300、400 mmol/L NaCl)，以防止鹽激效應(yīng)。以Hoagland營養(yǎng)液為對照(實(shí)際含有約2 mmol/L Na+)。為保持NaCl濃度恒定，每2d更換1次營養(yǎng)液。培養(yǎng)溫室的晝夜溫度為(30±2)℃/(23±2)℃，光周期15/9 h，白天最大光照強(qiáng)度約為1500 μmol m-2s-1，相對濕度40%—60%。NaCl處理7 d后，測定有關(guān)指標(biāo)。

1.2 測定方法

1.2.1 整株鮮重和葉綠素含量的測定

到達(dá)終濃度的當(dāng)天將整株植物從液體培養(yǎng)盆內(nèi)取出，輕輕吸去根部表面的水分，分別稱量葉片、莖和根的鮮重(FW)。整株鮮重=葉鮮重+莖鮮重+根鮮重，每個處理做10個重復(fù)。

選取蒔蘿蒿最幼功能葉測定葉綠素含量[14]。由于蒔蘿蒿是羽狀深裂葉，因此以鮮重為單位表示其葉綠素含量。

1.2.2 葉片肉質(zhì)化程度和細(xì)胞汁液滲透勢的測定

用葉片肉質(zhì)化程度表示葉片的含水量：首先稱量葉片鮮重(FW)，然后將鮮材料放入105 ℃的烘箱殺青10 min后，80 ℃烘干至恒重，稱量葉片干重(DW)。

葉片肉質(zhì)化程度=FW/DW×100%

每個處理做5個重復(fù)。

葉片液氮速凍后，放入注射器內(nèi)室溫下溶冰，然后擠出細(xì)胞汁液。細(xì)胞汁液滲透勢用蒸汽壓滲透壓計(jì)(Vapor Pressure Osmometer 5520，Hansatech Instrument Ltd., UK)測定。每個處理做5個重復(fù)。

1.2.3 葉片光合參數(shù)的測定

蒔蘿蒿幼苗在20:00充分暗適應(yīng)后，在黑暗條件下用HandyPEA (Plant Efficiency Analyser；Hansatech Instrument Ltd., UK)測定其最大光化學(xué)效率(maximal efficiency of PSⅡ photochemistry,Fv/Fm)。每個處理做5個重復(fù)。

光合速率(Pn)和氣孔導(dǎo)度(Gs)采用英國PP system公司的Ciras- 1型光合測定系統(tǒng)測定。測定條件為：CO2濃度360 μmol/mol、相對濕度40%，光照1000 μmol m-2s-1，溫度25 ℃。葉室中蒔蘿蒿羽狀葉葉面積用Li- 3000A葉面積儀(美國LI-COR)測定。每個處理做5個重復(fù)。

1.2.4 根、莖、葉Na+含量的測定

將每株植物分成根、莖、葉3部分，分別烘干、稱重。然后取0.1 g 干重的材料用馬弗爐在500 ℃充分灰化，用濃硝酸溶解，然后蒸餾水稀釋定容。Na+濃度用原子吸收光譜儀(Z- 8000型, Hitachi, Japan)測定。各器官中Na+含量用μmol/g 鮮重表示:

各器官中Na+總量=Na+含量×器官鮮重每個處理做5個重復(fù)。

1.2.5 葉片質(zhì)外體和原生質(zhì)體Na+含量的測定

質(zhì)外體液體的收集參照Tetlow的方法稍加改動[15]。取一定數(shù)量的完整葉片，將葉片莖基端向下置于容積為40 mL的注射器中，注射器下端出液口套一容積為0.5 mL的Eppendorff管，放入超速冷凍離心機(jī)中4 ℃、400g離心10 min，避免細(xì)胞破裂。質(zhì)外體液體順著注射器收集到Eppendorf管中，收集到的質(zhì)外體(apoplast)液體稀釋后測定其Na+濃度(Ca)。方法1.2.2中得到的細(xì)胞汁液[其中含有質(zhì)外體溶液和原生質(zhì)體(protoplast)溶液兩部分] 4000g離心10 min，取上清液用于Na+濃度的測定(CT)。參照Flowers的方法，假定質(zhì)外體與原生質(zhì)體體積比約為3∶97，可推算原生質(zhì)體溶液的平均Na+濃度(Cp)[16]:

Cp=(CT×1-Ca×Va)/Vp

式中,Va= 1×3%,Vp=1× 97%。每個處理做5個重復(fù)。

Na+在質(zhì)外體和原生質(zhì)體中的分布比例計(jì)算公式分別為：

Pa=Ca×Va/(Ca×Va+Cp×Vp)

Pp=Cp×Vp/(Ca×Va+Cp×Vp)

1.2.6 液泡膜微囊的制備

液泡膜微囊的提取參考Ballesteros 等人的方法[17]。以不同鹽濃度處理的蒔蘿蒿葉片為材料，用預(yù)冷重蒸水沖洗2—3次，用吸水紙吸去表面水分后，按材料∶勻漿緩沖液=1∶2加入預(yù)冷勻漿緩沖液，該緩沖液含有50 mmol/L Tricine-Tris (pH 7.5)，3 mmol/L EGTA, 3 mmol/L MgSO4，0.5% PVP，2 mmol/L DTT，0.2 mmol/L PMSF，5% 甘油(Glycerol)，并用甘露醇調(diào)至與葉片細(xì)胞汁液等滲。用勻漿機(jī)勻漿2次，四層紗布過濾。取濾液10000 r/min (Beckman, L- 80XP)離心20 min，一并除去線粒體及沒有破碎的細(xì)胞和細(xì)胞壁碎片。取離心后的上清液小心鋪在18%∶24%∶30%∶45%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))不連續(xù)蔗糖梯度溶液上(含5 mmol/L Hepes-Tris pH值7.5，1 mmol/L DTT)，100000g離心2h，小心收集24% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 界面上的膜微囊，來自24%界面的微囊富含液泡膜。用稀釋液(含有3 mmol/L MgSO4, 50 mmol/L Hepes-Tris pH值7.5, 1 mmol/L PMSF，1 mmol/L DTT)稀釋2—4倍，100,000×g 再離心30 min。離心后的沉淀用尖頭細(xì)毛筆小心懸浮在貯藏液[含有40% 甘油 (glycerin)，2 mmol/L DTT, 10 mmol/L Hepes-Tris (pH值=7.5)]中，用勻漿器混勻后分裝于Eppendorf管中，液氮中冷凍后，-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。以上操作均?—4 ℃條件下完成。用考馬斯亮藍(lán)法測定提取液中蛋白質(zhì)含量。

1.2.7 液泡膜H+-ATPase泵活性、Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性的測定

H+-ATPase泵活性和Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性測定均參照Ballesteros 等人的方法[17]。質(zhì)子泵活性的測定的反應(yīng)體系為2 mL，其中含有33 mmol/L Hepes-tris(pH值=7.5)，50 mmol/L KCl，0.1 mmol/L (NH4)2MoO4，166 mmol/L 甘露醇，0.05%牛血清蛋白，3 mmol/L DTT，1.5 mmol/L ATP-Na2，膜微囊制劑蛋白量100 μg。25 ℃保溫5 min，再加入濃度為1 mol/L的MgCl210 μL啟動反應(yīng)。用acridine orange作熒光染料，反應(yīng)體系中acridine orange的終濃度為5 μmol/L。測定熒光猝滅的初速度(激發(fā)波長為495 nm，發(fā)散波長為525 nm)。以單位時間內(nèi)熒光猝滅值占總熒光量的百分?jǐn)?shù)(%quench/min)表示。

熒光猝滅達(dá)到最大且穩(wěn)定時，加入15 μmol/L bafilomycin 20 μL終止V-H+-ATPase 活性，然后加入Na+(NaCl)，使體系中Na+濃度為100 mmol/L，測定熒光恢復(fù)的初速度，以單位時間內(nèi)熒光恢復(fù)值占總熒光量的百分?jǐn)?shù)(%quench/min)表示Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性。每個處理的兩種酶活性均做5個重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽處理對蒔蘿蒿生長狀況的影響

鹽處理顯著抑制了蒔蘿蒿的生長，隨著鹽處理濃度的升高，蒔蘿蒿整株鮮重顯著下降。100、200、300、400 mmol/L NaCl條件下的整株鮮重分別為對照的87.9%、79.0%、72.3%、65.7% (圖1)。地上部鮮重尤其是葉片鮮重下降最為顯著，分別為對照的84.5%、73.0%、64.0%、51.9%。鹽處理后，蒔蘿蒿的葉片數(shù)和葉片大小均顯著小于對照，在300—400 mmol/L NaCl下，老葉有發(fā)黃枯萎現(xiàn)象；但功能葉片的葉綠素含量顯著高于對照(圖1)，這是葉片生長受抑制后的常見表現(xiàn)。

圖1 鹽處理對蒔蘿蒿整株鮮重(a)和葉綠素含量(b)的影響Fig.1 Effect of salt-treatment on fresh weight of individual Artemisia anethifolia plants (a) and chlorophyll content (b)

2.2 鹽處理對蒔蘿蒿水分狀況的影響

蒔蘿蒿地上部分主要為葉片，葉片的水分狀況可以反映其生活狀態(tài)。為了適應(yīng)鹽漬條件下的低滲環(huán)境，其葉片的細(xì)胞汁液滲透勢也顯著下降，以提高其吸水能力(圖2)。400 mmol/L NaCl條件下蒔蘿蒿葉片細(xì)胞汁液滲透勢達(dá)到對照的2.07倍。蒔蘿蒿葉片的肉質(zhì)化程度卻顯著下降(圖2)。400 mmol/L NaCl條件下，蒔蘿蒿葉片肉質(zhì)化程度僅為對照的69.1%。

圖2 鹽處理對蒔蘿蒿葉片肉質(zhì)化程度和細(xì)胞汁液滲透勢的影響Fig.2 Effect of salt-treatment on leaf succulence degree and osmotic potential of leaf cell sap of Artemisia anethifolia plants

2.3 鹽處理對蒔蘿蒿葉片光合功能的影響

鹽處理后蒔蘿蒿葉片的光合功能顯著下降(圖3)，100、200、300和400 mmol/L NaCl條件下的凈光合速率分別為對照的70.6%、48.7%、40.5%和28.1%。氣孔導(dǎo)度的下降趨勢與凈光合速率類似，而蒔蘿蒿葉片的PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)不受鹽處理影響(圖3)。說明鹽處理抑制蒔蘿蒿的光合功能與氣孔因素有密切關(guān)系。

2.4 不同濃度鹽處理?xiàng)l件下蒔蘿蒿各器官中Na+的含量與分布

鹽處理后，蒔蘿蒿幼苗的各個器官中的Na+含量均顯著增加，但地上部的Na+含量均顯著高于根部，其中葉片的Na+含量最高(表1)，說明蒔蘿蒿并不阻止Na+運(yùn)往地上部。隨著鹽處理濃度的增加，葉片Na+含量增加幅度顯著小于根和莖，如400 mmol/L NaCl條件下葉、莖、根中Na+含量分別為100 mmol/L NaCl條件下的2.04、3.16和2.66倍。因此，在高鹽濃度下，蒔蘿蒿相對減緩了葉片Na+積累幅度。各器官中的Na+總量結(jié)果則顯示(表2)，在不同鹽漬條件下，葉片均是蒔蘿蒿Na+分布的主要器官，分布比例在70%以上。但隨著鹽濃度的升高，葉片Na+總量所占的比例逐漸降低，而根和莖中Na+總量所占的比例逐漸升高。

表1 不同鹽處理?xiàng)l件下蒔蘿蒿各器官中Na+含量(μmol/g鮮重)

表2 不同鹽處理?xiàng)l件下蒔蘿蒿各器官Na+總量(μmol)與分布比例

Table 2 Total Na+content (μmol) and distribution ratio in different organs ofArtemisiaanethifoliaplants under different concentrations of NaCl

器官OrganNaCl處理濃度/NaClconcentrations(mmol/L)CK100200300400葉Leaf154.5±16.8(88.9)940.8±30.7(82.8)1019.5±43.6(76.3)1147.0±53.8(75.0)1260.9±53.6(72.9)莖Stem2.7±0.4(1.7)28.4±2.5(2.5)45.0±4.3(3.4)57.9±5.6(3.8)71.9±8.1(4.8)根Root16.6±1.0(9.4)167.3±16.7(14.7)270.4±23.9(20.3)323.5±21.6(21.2)331.1±28.9(22.3)

圖3 鹽處理對蒔蘿蒿葉片光合功能的影響Fig.3 Effect of salt-treatment on photosynthetic function of Artemisia anethifolia leaf

2.5 不同濃度鹽處理?xiàng)l件下蒔蘿蒿葉片質(zhì)外體和原生質(zhì)體Na+濃度與分布

由于葉片是蒔蘿蒿積累Na+的主要器官，因此重點(diǎn)分析了葉片組織質(zhì)外體和原生質(zhì)體Na+濃度與分布(圖4)。隨著鹽處理濃度的增加，質(zhì)外體和原生質(zhì)體中的Na+濃度均顯著上升。但無論對照還是鹽處理?xiàng)l件下，原生質(zhì)體中的Na+平均濃度均顯著高于質(zhì)外體，CK、100、200、300和400 mmol/L NaCl條件下原生質(zhì)體Na+濃度分別為質(zhì)外體的1.8、1.7、1.5、1.3和1.2倍(圖4)，說明葉肉細(xì)胞可以主動吸收和積累Na+，但隨著鹽處理濃度的升高，原生質(zhì)體中的Na+相對濃度逐漸減小。

葉片積累的Na+主要分布在原生質(zhì)體中，在不同鹽濃度處理下，原生質(zhì)體的Na+總量均占葉片組織Na+總量的98%左右。CK、100、200、300和400 mmol/L NaCl條件下質(zhì)外體的Na+總量分別占葉片組織Na+總量1.7%、1.8%、2.1%、2.3%和2.4%(圖4)，從這組數(shù)據(jù)也可以看出在高鹽濃度下，質(zhì)外體積累Na+的數(shù)量相對增加。

2.6 不同濃度鹽處理?xiàng)l件下蒔蘿蒿葉片液泡膜V-H+-ATPase與Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性

鹽處理蒔蘿蒿葉片的液泡膜V-H+-ATPase質(zhì)子泵活性均顯著大于對照，100、200、300和400 mmol/L NaCl處理的V-H+-ATPase質(zhì)子泵活性分別為對照的1.3、1.3、1.4和1.5倍。但隨著鹽處理濃度的升高，V-H+-ATPase質(zhì)子泵活性的增加幅度放緩。如200、300、400 mmol/L NaCl條件下V-H+-ATPase質(zhì)子泵活性分別為100 mmol/L NaCl的1.07、1.15、1.17倍。300—400 mmol/L NaCl條件下，V-H+-ATPase質(zhì)子泵活性幾乎不再增加(圖5)。

蒔蘿蒿葉片的液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性的特點(diǎn)是在對照條件下活性較低，鹽處理后活性迅速增大，約為對照的4—7倍。同樣，隨著鹽處理濃度的升高，Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性的增加幅度放緩。如200、300、400 mmol/L NaCl條件下的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性分別為100 mmol/L NaCl的1.22、1.34、1.38倍。300—400 mmol/L NaCl條件下，Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性也幾乎不再增加(圖5)。

圖4 不同鹽處理?xiàng)l件下蒔蘿蒿葉片質(zhì)外體和原生質(zhì)體平均Na+濃度(μmol/mL)與分布比例Fig.4 Na+ concentration and distribution percentage in apoplast and protoplasts of Artemisia anethifolia leaf tissue under different concentrations of NaCl

圖5 不同鹽處理?xiàng)l件下蒔蘿蒿液泡膜V-H+-ATPase質(zhì)子泵活性和Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性的變化Fig.5 Changes in V-H+-ATPase proton pump activity and Na+/H+ antiporter activity of Artemisia anethifolia leaves under different concentrations of NaCl

3 討論

蒔蘿蒿具有較強(qiáng)的耐鹽能力，能夠在400 mmol/L NaCl條件下存活并生長。但其生長量隨著鹽處理濃度的升高而逐漸減小(圖1)，其主要原因可能與葉片的光合速率迅速下降有關(guān)。由于植物光合系統(tǒng)中所有的酶均對Na+非常敏感[8,18]，而蒔蘿蒿葉片的PSⅡ光化學(xué)活性未受到高鹽傷害(圖3)，葉綠素含量還顯著增加(圖1)，說明蒔蘿蒿能夠?qū)ζ涔庀到y(tǒng)進(jìn)行有效地保護(hù)。伴隨著光合速率的下降，蒔蘿蒿葉片的氣孔導(dǎo)度也顯著下降(圖3)，因此推測鹽處理抑制蒔蘿蒿的凈光合速率主要是由于氣孔因素引起的。

鹽生植物保護(hù)細(xì)胞質(zhì)免受傷害的共同機(jī)制是減少Na+在細(xì)胞質(zhì)中的積累，避免Na+毒害[19- 20]。避免細(xì)胞質(zhì)Na+毒害的方式主要有3種：拒鹽、泌鹽和稀鹽。蒔蘿蒿既沒有把鹽分阻隔在地下部，也不能通過大量吸水和快速生長稀釋鹽分。因此，蒔蘿蒿既不是拒鹽植物，也不是喜鹽植物，也沒有泌鹽結(jié)構(gòu)，它的耐鹽機(jī)制還未見報道。從本文結(jié)果可以看出，蒔蘿蒿的耐鹽機(jī)制是將吸收到體內(nèi)的鹽分主要積累在地上部尤其是葉片中，葉片中的Na+含量占整株植物的70%以上(表2)，也是Na+含量最高的器官(表1)。葉片中的鹽分則97%以上Na+均積累在原生質(zhì)體中(圖4)，由于細(xì)胞質(zhì)中的酶對Na+敏感，所以細(xì)胞質(zhì)中的Na+濃度一般不超過10 mmol/L[5,20]，因此蒔蘿蒿葉片中的Na+應(yīng)該主要積累在葉片細(xì)胞的液泡中[19,21]。蒔蘿蒿原生質(zhì)體中的Na+濃度高于質(zhì)外體也證明蒔蘿蒿區(qū)域化Na+的方式不是由細(xì)胞質(zhì)外排到質(zhì)外體，而是區(qū)域化到液泡內(nèi)。

Na+區(qū)域化是植物耐鹽的共同機(jī)制，其中Na+在液泡中的區(qū)域化最受關(guān)注[21]。液泡膜上兩種重要的酶參與了Na+在液泡內(nèi)的區(qū)域化：V-H+-ATPase和Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中V-H+-ATPase為Na+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)建立跨液泡膜的質(zhì)子能量梯度，Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是Na+區(qū)域化到液泡的載體[2- 5]。經(jīng)測定，鹽處理后二者的活性協(xié)同上調(diào)(圖5)，說明鹽處理后蒔蘿蒿增強(qiáng)了Na+區(qū)域化到液泡的能力，兩種酶活性的增加可能是由于蛋白質(zhì)的表達(dá)增加引起的[22- 23]。不過，當(dāng)鹽處理濃度達(dá)到300—400 mmol/L NaCl時，兩種酶的活性均不再增加，說明此時蒔蘿蒿的Na+區(qū)域化能力已經(jīng)達(dá)到了極限。在此濃度下，蒔蘿蒿的基部老葉出現(xiàn)明顯枯萎現(xiàn)象，是由于鹽分優(yōu)先積累在老葉，保護(hù)幼葉所致。圖5的結(jié)果顯示蒔蘿蒿的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性均是組成性表達(dá)的，這一特征與真鹽生植物類似[24]，耐鹽甜土植物的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性往往是鹽誘導(dǎo)表達(dá)的[21]。

由于Na+是通過蒸騰流進(jìn)入植物體的，蒔蘿蒿為了減少Na+的吸收所采取的方式是關(guān)閉氣孔(圖3)，降低蒸騰。但這一方式不可避免地影響了植物光合作用的氣體交換，從而抑制了自身的生長速度。降低蒸騰是植物在鹽漬滲透脅迫條件下的普遍反應(yīng)。但真鹽生植物如鹽地堿蓬(SuaedasalsaLinn.)在鹽漬條件下能夠利用Na+降低細(xì)胞汁液滲透勢[11]，且能大量吸收水分，快速生長而稀釋鹽分[13]。蒔蘿蒿也能利用Na+降低細(xì)胞汁液滲透勢(圖2)。但其葉片含水量卻隨著鹽處理濃度的升高而下降，這可能是蒔蘿蒿與真鹽生植物的主要區(qū)別。有文獻(xiàn)認(rèn)為真鹽生植物的吸水快速生長機(jī)制與鹽誘導(dǎo)增加水孔蛋白表達(dá)有關(guān)[25]。蒔蘿蒿葉片鹽處理后含水量下降很可能是因?yàn)槠淙狈φT導(dǎo)質(zhì)膜水孔蛋白大量表達(dá)的機(jī)制。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證明水孔蛋白活性增加可以提高植物光合能力和生物產(chǎn)量[26]，因此水孔蛋白可能在真鹽生植物的耐鹽性及快速生長機(jī)制中具有重要作用。

總之，眾多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明Na+區(qū)域化可以賦予植物耐鹽性，是耐鹽植物的共同特征。但是Na+區(qū)域化并不能使蒔蘿蒿避免鹽抑制生長現(xiàn)象，并未具備類似真鹽生植物適應(yīng)鹽漬環(huán)境而快速生長的能力。所以Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性是植物適應(yīng)鹽漬環(huán)境的必需條件而不是充分條件。

[1] Zhao K F, Li F Z. The halophytes in China. Beijing: Science Publishing House, 1999: 289- 292.

[2] Maeshima M. Tonoplast transporters: Organization and function. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 2001, 52(1): 469- 497.

[3] Mansour M M F, Salama K H A, Al-Mutawa M M. Transport proteins and salt tolerance in plants. Plant Science, 2003, 164(6): 891- 900.

[4] Hunte C, Screpanti E, Venturi M, Rimon A, Padan E, Michel H. Structure of a Na+/H+antiporter and insights into mechanism of action and regulation by pH. Nature, 2005, 435(7046): 1197- 1202.

[5] Sun J, Chen S L, Dai S X, Wang R G, Li N Y, Shen X, Zhou X Y, Lu C F, Zheng X J, Hu Z M, Zhang Z K, Song J, Xu Y. Ion flux profiles and plant ion homeostasis control under salt stress. Plant Signaling Behavior, 2009, 4(4): 261- 264.

[6] Ohta M, Hayashi Y, Nakashima A, Hamada A, Tanaka A, Nakamura T, Hayakawa T. Introduction of a Na+/H+antiporter gene fromAtriplexgmeliniconfers salt tolerance to rice. FEBS Letters, 2002, 532(3): 279- 282.

[7] Chinnusamy V, Jagendorf A, Zhu J K. Understanding and improving salt tolerance in plants. Crop Science, 2005, 45(2): 437- 448.

[8] Yang Q, Chen Z, Zhou X, Yin H, Li X, Xin X, Hong X, Zhu J K, Gong Z. Overexpression of SOS (Salt Overly Sensitive) genes increases salt tolerance in transgenic Arabidopsis. Molecular Plant, 2009, 2(1): 22- 31.

[9] Oh D H, Lee S Y, Bressan R A, Yun D J, Bohnert H J. Intracellular consequences of SOS1 deficiency during salt stress. Journal of Experimental Botany, 2010, 61(4): 1205- 1213.

[10] Daines R J, Gould A R. The cellular basis of salt tolerance studied with tissue cultures of the halophytic grassDistichlisspicata. Journal of Plant Physiology, 1985, 119(3): 269- 280.

[11] Qiu N W, Chen M, Guo J R, Bao H Y, Ma X L, Wang B S. Coordinate up-regulation of V-H+-ATPase and vacuolar Na+/H+antiporter as a response to NaCl treatment in a C3halophyteSuaedasalsa. Plant Science, 2007, 172(6): 1218- 1225.

[12] Zhao F Y, Guo S L, Zhang H, Zhao Y X. Expression of yeastSOD2 in transgenic rice results in increased salt tolerance. Plant Science, 2006, 170(2): 216- 224.

[13] Li WQ, Liu X J, Zhao K F, Liu H L. Growth, development and ions distribution of three halophytes under salt stress. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2006, 14(2): 49- 52.

[14] Zhang Q D. Several methods of determination of chlorophyll. Chinese Bulletin of Botany, 1985, 3(5): 60- 64.

[15] Tetlow I J, Farrar J F. Apoplastic sugar concentration and pH in barley leaves infected with brown rust. Journal of Experimental Botany, 1993, 44(5): 929- 936.

[16] Flowers T J, Yeo A R. Ion relations of plants under drought and salinity. Australian Journal of Plant Physiology, 1986, 13(1): 75- 91.

[17] Ballesteros E, Blumwald E, Donaire J P, Belver A. Na+/H+antiport activity in yonoplast vesicles isolated from sunflower Roots induced by NaCl stress. Physiologia Plantarum, 1997, 99(2): 328- 334.

[18] Zhang L R, Xing D. Rapid determination of the damage to photosynthesis caused by salt and osmotic stresses using delayed fluorescence of chloroplasts. Photochemistry and Photobiology Science, 2008, 7(3): 352- 360.

[19] Munns R, Tester M. Mechanisms of salinity tolerance. Annual Review of Plant Biology, 2008, 59(1): 651- 681.

[20] Zhu J K. Regulation of ion homeostasis under salt stress. Current Opinion in Plant Biology, 2003, 6(5): 441- 445.

[21] Qiu N W, Yang H B, Wang B S. The Na+/H+antiporter and its relation to salt tolerance in plants. Plant Physiology Communications, 2001, 37(3): 260- 264.

[22] Han N, Shao Q, Lu C M, Wang B S. The leaf tonoplast V-H+-ATPase activity of a C3halophyteSuaedasalsais enhanced by salt stress in a Ca-Dependent mode. Journal of Plant Physiology, 2005, 162(3): 267- 274.

[23] Queirós F, Fontes N, Silva P, Almeida D, Maeshima M, Gerós H, Fidalgo F. Activity of tonoplast proton pumps and Na+/H+exchange in potato cell cultures is modulated by salt. The Journal of Experimental Botany, 2009, 60(4): 1363- 1374.

[24] Hasegawa P M, Bressan R A, Zhu J K, Bohnert H J. Plant cellular molecular responses to high salinity. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 2000, 51(1): 463- 499.

[25] Qi C H, Chen M, Song J, Wang B S. Increase in aquaporin activity is involved in leaf succulence of the euhalophyteSuaedasalsaunder salinity. Plant Science, 2009, 176(2): 200- 205.

[26] Uehlein N, Lovisolo C, Siefritz F, Kalenhoff R. The tobacco aquaporin NtAQP1 is a membrane CO2pore with physiological functions. Nature, 2003, 425(6959): 734- 737.

參考文獻(xiàn):

[1] 趙可夫, 李法曾. 中國鹽生植物. 北京: 科學(xué)出版社, 1999: 289- 292.

[13] 李偉強(qiáng), 劉小京, 趙可夫, 劉海亮. NaCl 脅迫下3 種鹽生植物生長發(fā)育及離子在不同器官分布特性研究. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2006, 14(2): 49- 52.

[14] 張其德. 測定葉綠素的幾種方法. 植物學(xué)通報, 1985, 3(5): 60- 64.

[21] 邱念偉, 楊洪兵, 王寶山. Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其與植物耐鹽性的關(guān)系. 植物生理學(xué)通訊, 2001, 37(3): 260- 264.

Na+compartmentation and physiological characteristics ofArtemisiaanethifoliain adaptation to saline environment

QIU Nianwei1, YANG Cuicui1, LU Zhengke1, LI Zunning1, YUE Xianjun1, CHENG Xiuxiu1, XU Yingying1, ZHOU Feng2,*

1CollegeofLifeSciences,QufuNormalUniversity,Qufu,Shandong273165,China2SchoolofBiochemicalandEnvironmentalEngineering,NanjingXiaozhuangUniversity,Nanjing,Jiangsu211171,China

Artemisiaanethifolia(Compositae) is a halophyte that is widely distributed in northern areas of China. Studying the mechanisms by which this plant adapts to high levels of salt will increase our understanding of salt adaptation in vascular plants.A.anethifoliaplants were treated with 0, 100, 200, 300, and 400 mmol/L NaCl for 7 d, respectively. Then, the differences in growth and physiology were compared between salt-treated and controlA.anethifoliaplants. In particular, the Na+accumulation levels and Na+compartmentation patterns inA.anethifoliaplants were analyzed in detail. Although theA.anethifoliaplants were able to survive under 400 mmol/L NaCl, salt-treated plants showed lower fresh weight as the NaCl concentration increased, indicating that plant growth was inhibited by salt. The leaves ofA.anethifoliashowed an increased capacity for osmotic adjustment but a decreased degree of leaf succulence with increasing NaCl concentrations. Photosynthetic analyses showed that there was a gradual decline in net photosynthetic rate and stomatal conductance of salt-treated leaves with increasing NaCl concentrations. However, the maximal efficiency of photosystem II photochemistry (Fv/Fm) inA.anethifolialeaves was not inhibited by salt, and the chlorophyll content even increased with increasing salt concentrations. These observations suggested that the decreased photosynthetic rate was due to stomatal factors, rather than damage to the components of the photosynthetic machinery. The Na+content inA.anethifoliaplants tended to increase with increasing salt concentrations. The Na+content in leaves, stems, and roots ofA.anethifoliawas 321.4, 242.1, and 182.3 μmol/g FW, respectively, in the 400 mmol/L NaCl treatment. More than 70% of the Na+absorbed by salt-treatedA.anethifoliaplants accumulated in their leaves, and approximately 98% of the Na+that accumulated in leaves was localized in leaf protoplasts. The average Na+concentration in protoplasts ofA.anethifolialeaf tissue was 1.2—1.8 times that in the apoplast. These results indicate that efficient Na+compartmentation occurred inA.anethifolialeaf cells. The V-H+-ATPase proton pump activity of salt-treated leaves was 30%—50% higher than that of control leaves, and the tonoplast Na+/H+antiporter activity of salt-treated leaves was 4—7 times that in leaves of control plants. These findings suggested thatA.anethifoliaplants have a strong ability to compartmentalize Na+in the vacuole. As the concentrations of salt increased, the Na+distribution ratio in leaves decreased. Likewise, the range of increased V-H+-ATPase proton pump activity and tonoplast Na+/H+antiporter activity decreased as the salt concentration increased. Na+compartmentation plays an important role in the salt tolerance ofA.anethifoliaplants, because it protects their photosystems and results in lower osmotic potential in the leaf cells. However, Na+compartmentation could not prevent the decrease in the degree of leaf succulence and the photosynthetic activity ofA.anethifolialeaves under highly saline conditions, and so their growth was inhibited by salt. These results suggest that Na+compartmentation is necessary but not sufficient for adaptation ofA.anethifoliato a saline environment.

Artemisiaanethifolia; Na+compartmentation; growth; photosynthesis; adaption

江蘇省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(BK2012073); 國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(2011KF07)

2013- 01- 31; 網(wǎng)絡(luò)出版日期:2014- 03- 13

10.5846/stxb201301310204

*通訊作者Corresponding author.E-mail: zfibcas@163.com

邱念偉,楊翠翠, 盧正珂, 李遵寧, 岳賢軍, 程秀秀, 許瑩瑩, 周峰.蒔蘿蒿適應(yīng)鹽漬環(huán)境的Na+區(qū)域化方式和生理特征.生態(tài)學(xué)報,2014,34(21):6147- 6155.

Qiu N W, Yang C C, Lu Z K, Li Z N, Yue X J, Cheng X X, Xu Y Y, Zhou F.Na+compartmentation and physiological characteristics ofArtemisiaanethifoliain adaptation to saline environment.Acta Ecologica Sinica,2014,34(21):6147- 6155.